基于平衡糖利用高产D-泛酸的工程菌、其构建方法与应用技术

技术编号：44019768 阅读：4 留言：0更新日期：2025-01-15 01:04

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种基于平衡糖利用高产D‑泛酸的工程菌、其构建方法与应用。首先，本发明专利技术通过弱化糖酵解EMP途径的pfkB、eno与pgi基因，同时过表达zwf与pgl基因，将部分碳流量通过推拉的方式流入PPP途径；其次，敲除了6‑磷酸果糖激酶II PfkB、修改烯醇化酶基因eno的起始密码子以及减弱葡萄糖磷酸异构酶Pgi的酶活；随后，为了让碳流量进一步流向PPP与ED途径，过表达PPP与ED共有基因zwf和pgl，并引入源于运动发酵单胞菌的edd与eda基因，打通了大肠杆菌中的ED途径；再有，将多余的PPP途径的碳流量分配给TCA循环，在基因组中整合来源于青春双歧杆菌的fxpk基因以及克鲁伊维梭菌的pta基因；最后，通过上述共同作用，使D‑泛酸效价达到了4.80 g/L。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程，尤其涉及基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌、其构建方法与应用。

技术介绍

1、代谢工程旨在以微生物作为细胞工厂来最大限度地生产高附加值的化合物。如何构建细胞工厂，在有效的调控下实现高产量与高转化率以及在保证菌株正常生长的情况下，如何将碳流量尽可能的传递给产物的合成，减少碳源的浪费，均是生物合成法生产产品的一大研究重心。此外，产物的产量是工业化产品是否实现的标准，直观强化产品合成的方法，加强产物积累，是目前代谢工程改造的首要操作之一。

2、然而，现有技术中往往存在以下问题：工程途径的整合会使宿主细胞生长缓慢，进而影响菌株的生产性能，在细胞生长和生产产生了冲突；此外，在保证菌株正常生长的最低限度下，多余的碳流量均分流至副产物，造成碳源的浪费。把代谢通路比作水管，碳流量则为通过的水流，为了缓解上述现有技术的问题，需要合理分配水流的流向与流速，使得在相同初始碳总量的前提下，最终更多的流量流向产物的生产而不是溢出。

3、泛酸（d-pa），也称为维生素b5，是辅酶a的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中举足轻重。目前，用于工业应用的d-pa主要利用d-泛解酸内酯和 β-丙氨酸在甲醇或乙醇中缩合的化学方法进行生产。然而，使用化学分离或酶催化产生的酯涉及到有毒的化学试剂和昂贵的分离手段。随着基因工程和合成生物学的不断发展，利用环保、廉价和简单等特点的生物合成手段生产d-pa引起了学者们的广泛关注。但目前利用生物法生产d-pa仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。

技术实现思路

1、为了解决上述d-泛酸产量低的技术问题，本专利技术提供了一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌、其构建方法与应用。

2、本专利技术的具体技术方案为：

3、第一方面，本专利技术提供了一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌。在所述工程菌的基因组中，包括：

4、强化表达 zwf基因、 pgl基因、 edd基因、 eda基因、 fxpk基因、 pta基因；

5、弱化 eno基因、 pgi基因；

6、敲除 pfkb基因。

7、基于平衡糖利用，本专利技术提供了上述高产d-泛酸的工程菌，本专利技术：（1）敲除6-磷酸果糖激酶2基因 pfkb，弱化6-磷酸果糖到1, 6-2磷酸果糖的转化速度；（2）降低烯醇化酶eno的表达量，弱化3-磷酸甘油酸到磷酸烯醇式丙酮酸的转化速度；（3）弱化 pgi基因，使葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi的部分酶活失活，将碳流量大幅引入ppp与ed途径；（4）强化表达ppp与ed途径共有酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf与6-磷酸葡萄糖酸乳酸酶pgl，增加还原力nadph的同时平衡碳流量分配；（5）引入并强化表达葡萄糖酸磷酸脱水酶edd基因与kdpg醛缩酶eda基因，促使碳流量往ed途径驱动；（6）强化表达双功能磷酸酮酶fxpk与磷酸乙酰转移酶pta，将ppp途径多余的碳流量转化为乙酰辅酶a供给生长。通过上述作用，修改了emp、ppp的碳流量分配，弱化了emp，引入外源edp，并将部分ppp的流量引入tca循环，从而消除了emp弱化带来的对细胞生长产生的负面影响，在此之下构建了一株性能优异的d-泛酸生产菌株。

8、作为优选， edd基因来源于运动发酵单胞菌， eda基因来源于运动发酵单胞菌， fxpk基因来源于青春双歧杆菌， pta基因来源于克鲁伊维梭菌。

9、糖酵解碳源的过量积累容易导致乙酸、乳酸副产物的堆积。在emp、ppp与ed三者中，emp途径是最长最复杂的一条，而ed途径的步骤相对最少，为此本申请引入异源ed途径并进行过表达，由此平衡三者的碳流量分布。本专利技术试验验证，引用异源ed途径并进行过表达后，d-泛酸产量大大提升。

10、第二方面，本专利技术提供了一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

11、（1）在底盘菌中敲除 pfkb基因；

12、（2）将 eno基因的起始密码子atg替换为ttg；

13、（3）对pgi基因进行突变，使 pgi基因编码蛋白的386位氨基酸组氨酸突变为酪氨酸；

14、（4）在底盘菌中强化表达 zwf基因；

15、（5）在底盘菌中强化表达 pgl基因；

16、（6）在底盘菌中强化表达 edd基因；

17、（7）在底盘菌中强化表达 eda基因；

18、（8）在底盘菌中强化表达 fxpk基因；

19、（9）在底盘菌中强化表达 pta基因。

20、作为优选，所述底盘菌为大肠杆菌。

21、作为优选，所述底盘菌的基因型为： e. coliw3110 derivative, trc- pancpanepanb/ ilvc/ ilvg */δ avta/ ilve */ coaa*/△ poxb/δ pta/δ plfb/δ ldha/trc- pyka/ ilvn*/ ilvh*/ spot*/trc- spot*/trc- lpd/trc- ilvd/δ laci/trc- 本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于平衡糖利用高产D-泛酸的工程菌，其特征在于：在所述工程菌的基因组中，包括：

2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：edd基因来源于运动发酵单胞菌，eda基因来源于运动发酵单胞菌，fxpk基因来源于青春双歧杆菌，pta基因来源于克鲁伊维梭菌。

3.一种基于平衡糖利用高产D-泛酸的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为大肠杆菌。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌的基因型为：E. coli W3110derivative, Trc-panCpanEpanB/ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/△poxB/Δpta/ΔplfB/ΔldhA/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/spoT*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI/Trc-alaS/Trc-ilvD/ptsG::Trc-glk, galP。

6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤（9）中，所述强化表达

7.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤（4）、步骤（5）中，所述强化表达为：将待强化表达的基因的原始启动子替换为Trc启动子后，替换底盘菌基因组中的相应的原位基因。

8.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤（6）、步骤（7）、步骤（8）中，所述强化表达为：将待强化表达的基因的原始启动子替换为Trc启动子后，替换底盘菌基因组中的假基因。

9.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，使pgi基因编码蛋白的386位的密码子突变为UAU。

10.如权利要求1或2所述的基因工程菌，或权利要求3~9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在制备D-泛酸中的应用。

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【技术特征摘要】

1.一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌，其特征在于：在所述工程菌的基因组中，包括：

3.一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为大肠杆菌。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌的基因型为：e. coli w3110derivative, trc-pancpanepanb/ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/△poxb/δpta/δplfb/δldha/trc-pyka/ilvn*/ilvh*/spot*/trc-spot*/trc-lpd/trc-ilvd/δlaci/trc-alas/trc-ilvd...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，王屹竑，周俊平，张博，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人