【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及基于调节糖摄取途径高产d-泛酸的工程菌及其制备方法。
技术介绍
1、生物发酵生产法具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而备受关注，菌株的性能在发酵过程中起到了至关重要的作用，直接影响了生产工艺中的发酵周期以及时空转化率。因此，提升菌株的生长速度、稳定产物的产量与转化率仍是目前的一大挑战。
2、泛酸(d-pa)，也称为维生素b5，是辅酶a的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中举足轻重。目前，用于工业应用的d-pa主要利用d-泛解酸内酯和β-丙氨酸在甲醇或乙醇中缩合的化学方法进行生产。然而，使用化学分离或酶催化产生的酯涉及到有毒的化学试剂和昂贵的分离手段。随着基因工程和合成生物学的不断发展，利用环保、廉价和简单等特点的生物合成手段生产d-pa引起了学者们的广泛关注。但目前利用生物法生产d-pa仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。
技术实现思路
1、为了解决上述d-泛酸产量低的技术问题，本专利技术提供了一种基于调节糖摄取途径高产d-泛酸的工程菌及其制备方法。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种基于调节糖摄取途径高产d-泛酸的工程菌。在所述工程菌的基因组中，包括：
4、强化表达card基因、rpfb基因；
5、敲除mgsa基因、adhe基因、lpp基因、nlpi基因、mlae基因、tola基因。
6、作为优选，card基因来源
7、作为优选，rpfb基因来源于新金色分枝杆。
8、本专利技术首先通过强化表达新金色分枝杆菌必要的全局调控转录因子card，稳定在rrna基因上形成的rnap启动子开放复合体；其次强化表达新金色分枝杆菌rpf/sps家族蛋白rpfb，作为复苏促进因子发挥作用，催化肽聚糖合成加速细胞壁生长；同时，失活胞壁质脂蛋白lpp积累外膜囊泡；另外，删除负责调节内肽酶meps和pbp4活性的脂蛋白nlpi，产生超级囊泡；再有，突变膜脂质不对称途径蛋白mlae，扰乱外膜稳态，增加囊泡形成；再有，破坏膜锚定蛋白tola以改善膜渗透性；最终得到了一株d-泛酸生产性能大幅提升的大肠杆菌基因工程菌株。
9、第二方面，本专利技术提供了一种调节糖摄取途径高产d-泛酸的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
10、(1)取card基因替换底盘菌基因组中的mgsa基因，并强化表达card基因；
11、(2)取rpfb基因替换底盘菌基因组中的adhe基因，并强化表达rpfb基因；
12、(3)在底盘菌基因组中敲除lpp基因；
13、(4)在底盘菌基因组中敲除nlpi基因；
14、(5)在底盘菌基因组中敲除mlae基因；
15、(6)在底盘菌基因组中敲除tola基因。
16、作为优选，所述底盘菌为大肠杆菌。
17、作为优选，所述底盘菌的基因型为：e.coli w3110 derivative,
18、trc-pancpanepanb/ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/△poxb/δpta/δplfb/δldha/trc-pyka/ilvn*/ilvh*/spot*/trc-spot*/trc-lpd/trc-ilvd/δlaci/trc-alas/trc-ilvd/ptsg::trc-glk,galp。
19、作为优选，步骤(1)中，所述card基因来源于新金色分枝杆。
20、作为优选，步骤(2)中，所述rpfb基因。
21、作为优选，步骤(1)、步骤(2)中，所述强化表达为：将待强化表达的基因的原始启动子替换为trc启动子。
22、本专利技术上述方法(1)～(6)各步骤原理为：
23、(1)将来源于新金色分枝杆的受ptrc99a的trc启动子调控的card基因替换掉出发菌株dpa-sa基因组上原有基因mgsa，阻断mgsa基因介导生成的甲基乙二醛及d-乳酸与乙醇的同时，强化card基因对细胞的全局调控；
24、(2)将来源于新金色分枝杆的受ptrc99a的trc启动子调控的rpfb基因替换掉工程菌sa-w1基因组上原有基因adhe，阻断adhe基因介导生成的乙醛及乙醇的同时，强化rpfb基因对细胞恢复休眠的功能；
25、(3)将底盘菌基因组中的lpp基因敲除，失活胞壁质脂蛋白并积累外膜囊泡；
26、(4)将底盘菌基因组中的nlpi基因敲除，删除负责调节内肽酶meps和pbp4活性的脂蛋白以产生超级囊泡；
27、(5)将底盘菌基因组中的mlae基因敲除，扰乱外膜稳态，增加囊泡形成；
28、(6)将底盘菌基因组中的tola基因敲除，破坏膜锚定蛋白以改善膜渗透性。
29、本专利技术通过上述各个步骤的共同作用，调节大肠杆菌的糖摄取途径，得到了生产性能大幅提升的d-泛酸生产菌株，同时该菌株的d-泛酸也大大提升。
30、第三方面，本专利技术提供了上述构建方法构建得到的基因工程菌在制备d-泛酸中的应用。
31、与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
32、(1)本专利技术首先通过强化表达新金色分枝杆菌必要的全局调控转录因子card，稳定在rrna基因上形成的rnap启动子开放复合体；其次强化表达新金色分枝杆菌rpf/sps家族蛋白rpfb，作为复苏促进因子发挥作用，催化肽聚糖合成加速细胞壁生长；同时，失活胞壁质脂蛋白lpp积累外膜囊泡；另外，删除负责调节内肽酶meps和pbp4活性的脂蛋白nlpi，产生超级囊泡；再有，突变膜脂质不对称途径蛋白mlae，扰乱外膜稳态，增加囊泡形成；再有，破坏膜锚定蛋白tola以改善膜渗透性；通过上述操作的共同作用，最终得到了一株d-泛酸生产性能大幅提升的大肠杆菌基因工程菌株。
33、(2)本专利技术几乎破坏了细胞壁内外膜中间的所有部分，篡改了细胞壁膜的完整性，并过度破坏细胞壁，但细胞生长不仅没受抑制，反而得以促进，稳定了生长较慢的底盘菌的生产性能，此为工业化菌株的优化提供了一种新策略。
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1.一种基于调节糖摄取途径高产D-泛酸的工程菌，其特征在于：在所述工程菌的基因组中，包括：
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：carD基因来源于新金色分枝杆。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：rpfB基因来源于新金色分枝杆。
4.一种基于平衡糖利用高产D-泛酸的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为大肠杆菌。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌的基因型为：E. coli W3110derivative, Trc-panCpanEpanB/ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/△poxB/Δpta/ΔplfB/ΔldhA/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/spoT*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI/Trc-alaS/Trc-ilvD/ptsG::Trc-glk, galP。
7.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述carD基
8.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，所述rpfB基因。
9.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于：步骤（1）、步骤（2）中，所述强化表达为：将待强化表达的基因的原始启动子替换为Trc启动子。
10.如权利要求1~3任一项所述的基因工程菌，或权利要求4~9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在制备D-泛酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于调节糖摄取途径高产d-泛酸的工程菌，其特征在于：在所述工程菌的基因组中，包括：
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：card基因来源于新金色分枝杆。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：rpfb基因来源于新金色分枝杆。
4.一种基于平衡糖利用高产d-泛酸的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为大肠杆菌。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌的基因型为：e. coli w3110derivative, trc-pancpanepanb/ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/△poxb/δpta/δplfb/δld...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，王屹竑，周俊平，张博，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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