【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学，尤其涉及一种检测细胞稳定性的方法。
技术介绍
1、随着生物技术的进步，基础科研得到广泛的关注，尤其在类器官培养、前沿医学治疗及细胞农业方向得以快速发展，综合来讲，细胞在体外的应用技术得到广泛和快速的提升。此外，细胞科学、细胞医学及细胞农业相关的研究进一步向细胞改造的方向发展，随之带来的是细胞安全问题的探讨和评价，但是，目前以细胞为底盘技术的各个方向的发展仍然存在着重大挑战，尤其在细胞体外培养和使用过程中细胞状态、细胞异变及细胞稳定性等的判断，导致目前体外细胞使用过程仍然处于高成本、低效率的阶段，同时在商业化使用过程中通过技术手段完成对细胞的评价仍然是一项重大挑战。
2、除了通过活性检测查看细胞群体某一个时间点的总体状况以外，还需要更为综合的、实时可以实施的、更全面、更深层的评价手段。因此本专利技术开发了针对细胞培育肉用细胞本身稳定性和可实时评价、连续评价、综合评价的细胞稳定性评价方案，包含细胞增殖、细胞迁移、细胞粘附、细胞活力、细胞凋亡、细胞自噬、细胞癌变、细胞衰老等多方面评价因素，可用于细胞连续传代、细胞实验、细胞类器官培养、细胞培育肉及细胞医疗等过程使用的细胞全面评价技术。
3、因此，细胞稳定性评价目前尚未被关注但生命科学研究领域及针对细胞的工业化应用过程亟须解决的针对培育肉细胞连续传代过程中细胞生命活动、功能检测及稳定性评价的技术方案是目前所需要。
技术实现思路
1、为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种检测细胞稳定性的方法
2、解决以上技术问题的本专利技术中的一种检测细胞稳定性的方法，包括细胞样品，其特征在于：所述细胞样品包括经细胞功能、细胞异变、细胞稳定性能三个方面的检测，其中当细胞增殖效果良好、细胞不发生迁移行动、细胞活力>80%、细胞早期及晚期凋亡比例≤10%、细胞自噬比例＜5%、细胞无原癌基因显著表达、细胞核型分析为染色体数目和形态无异变；细胞粘附指标：2h内有明显粘附即可；细胞毒性指标≤10%、细胞衰老比例占比≤20%和细胞倍增时间＜48小时的细胞为稳定细胞；若其中一项指标没有达到标准，则为细胞传代不稳定，中止细胞培育进程。
3、细胞稳定性评价的关键指标，是衡量细胞培育肉相关细胞使用周期、判断细胞的最佳经济/效率使用寿命的评判技术，可以在细胞培育肉方向奠定技术基础，在细胞农业、生物医疗和基础研究等领域具有广阔的应用前景。
4、本专利技术中检测方法可鉴定0-35代或更多代的细胞稳定性，筛选稳定传代细胞株以用于细胞培育肉的研发和优化，可为细胞培育肉高效制造奠定技术基础，可评价细胞使用过程种的经济/效率效价，筛选最优使用寿命周期的细胞实现培育肉制造。
5、本专利技术中一种检测细胞稳定性的方法，具体步骤如下：
6、（1）获取细胞样品：所述细胞为用于细胞培育肉的种子细胞；
7、（2）将细胞进行体外培养；
8、（3）细胞性能的检测：对细胞增殖、细胞迁移能力或细胞活力等进行检测，其中细胞增殖效果良好、细胞不发生迁移行动和细胞活力>80%；整体的细胞增殖、迁移和活力等属于细胞性能检测的一部分；
9、或细胞异变的检测：对细胞凋亡比例、细胞自噬比例或细胞癌变等检测，其中细胞早期及晚期凋亡比例≤10%、细胞自噬比例＜5%和细胞无原癌基因显著表达；
10、或细胞稳定性能的检测：对核型分析、细胞粘附、细胞衰老和细胞毒性等检测：其中细胞核型分析为染色体数目和形态无异变；细胞粘附指标：2h内有明显粘附即可；细胞毒性指标≤10%、细胞衰老比例占比≤20%和细胞倍增时间＜48h；
11、细胞稳定性能的检测中也可做细胞组学分析；
12、（4）所述步骤（3）中的指标检测无先后顺序之分，任一指标不达标即可判段该细胞稳定性不达标；
13、优化方案中，所述细胞样品包括原代细胞、生物工程改造细胞和永生化细胞等；
14、所述细胞来源包括人、鼠、猪、鸡、牛、羊等。
15、进一步骤优化方案中，所述步骤（3）细胞稳定性能的检测中，细胞核型分析检测包括以下步骤：通过秋水仙素进行染色体核型分析测定细胞染色体的异位突变情况，然后将所述细胞与x-gal底物混合进行反应，再通过观察是否生成深蓝色产物判断细胞是否拥有观察衰老特异性的β-半乳糖苷酶。
16、所述β-半乳糖苷酶通过催化x-gal显示生成深蓝色产物。
17、所述步骤（3）细胞性能的检测中，细胞迁移能力测定采用细胞划痕实验，通过细胞爬片状态判断细胞迁移能力。
18、所述步骤（3）细胞异变的检测中，细胞凋亡比例测定采用细胞流式实验，通过观察不同代数细胞凋亡比例进行经济/效率细胞生命周期评价，判断细胞是否适应规模化增殖过程。
19、所述步骤（3）细胞异变的检测中，细胞自噬比例测定通过lc3b兔多克隆抗体与吞噬细胞结合产生标记，作为自噬膜的一般标记再通过荧光显微镜和高含量成像与分析来判断细胞自噬情况。
20、所述步骤（3）细胞稳定性能的检测中，细胞粘附性能的测定通过荧光染料钙黄绿素乙酰氧基甲酯来测量。
21、所述步骤（3）细胞稳定性能的检测中，细胞毒性水平（≤10%）测定通过将所述细胞等份转移到新板中，并添加cyquant™ ldh细胞毒性测定试剂盒反应混合物，乳酸脱氢酶(ldh)是一种存在于许多不同细胞类型中的胞质酶，质膜受损会将ldh释放到周围的细胞培养基中，然后培养基中的细胞外ldh可以通过偶联酶反应使用酶标仪进行定量，可有效反映细胞毒性水平。
22、本专利技术提供以上所述的细胞稳定性评价方法在以下任一种中的应用：
23、（1）在细胞连续传代过程中的应用；
24、（2）在细胞类器官培养中的应用；
25、（3）在细胞培育肉中的应用；
26、（4）先进细胞医学术前安全评价。
27、本专利技术中检测方法解决了目前没有综合评价技术和方案的问题，同时对现有判断方案单一、片面等问题，可作为一种商业化的细胞评价方案和细胞检测及评价方法，实现细胞状态评估，具有良好的效率和安全性，能够较好地支持细胞进行相关应用，可在培养皿、生物反应器等多种细胞培养装置中进行扩增细胞的连续检测、综合评价，可用于细胞连续传代、细胞培育肉应用。具体的优势至少包括以下几方面：
28、（1）本专利技术提供的细胞稳定性评价方法可直接对细胞状态进行全方面的评价，也可通过特定需求增减评价方案，开发了商业化的细胞稳定性评价新方法；
29、（2）本专利技术提供的细胞稳定性评价方法能够最大程度地了解细胞状态以及细胞体外应用的三维生长环境，有利于细胞在体外的培养及应用；
30、（3）本专利技术提供的细胞稳定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测细胞稳定性的方法，包括细胞样品，其特征在于：所述细胞样品包括经细胞功能、细胞异变、细胞稳定性能三个方面的检测，其中当细胞增殖效果良好、细胞不发生迁移行动、细胞活力>80%、细胞早期及晚期凋亡比例≤10%、细胞自噬比例＜5%、细胞无原癌基因显著表达；细胞核型分析为染色体数目和形态无异变；细胞粘附指标：2h内有明显粘附即可；细胞毒性指标≤10%、细胞衰老比例占比≤20%和细胞倍增时间＜48小时的细胞为稳定细胞；若其中一项指标没有达到标准，则为细胞传代不稳定，中止细胞培育进程。
2.根据权利要求1所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：具体步骤如下：
3.根据权利要求1或2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述细胞样品包括原代细胞、生物工程改造细胞和永生化细胞。
4.根据权利要求1或2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述细胞来源包括人、鼠、猪、鸡、牛和羊。
5.根据权利要求2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述步骤（3）细胞稳定性能的检测中，细胞核型分析包括以下步骤：通过秋水仙
6.根据权利要求5中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述β-半乳糖苷酶通过催化X-Gal显示生成深蓝色产物。
7.根据权利要求2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述步骤（3）细胞性能的检测中，细胞迁移能力测定采用细胞划痕实验，通过细胞爬片状态判断细胞迁移能力。
8.根据权利要求2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述步骤（3）细胞异变的检测中，细胞凋亡比例测定采用细胞流式实验，通过观察不同代数细胞凋亡比例进行经济/效率细胞生命周期评价，判断细胞是否适应规模化增殖过程。
9.根据权利要求2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述步骤（3）细胞异变的检测中，细胞自噬比例测定通过LC3B兔多克隆抗体与吞噬细胞结合产生标记，作为自噬膜的一般标记再通过荧光显微镜和高含量成像与分析来判断细胞自噬情况；所述细胞稳定性能的检测中，细胞粘附性能的测定通过荧光染料钙黄绿素乙酰氧基甲酯来测量。
10.权利要求1或2中所述检测细胞稳定性的方法的应用，其特征在于：所述方法在细胞连续传代过程、细胞类器官培养、制备细胞培育肉和先进细胞医学术前安全评价中任一种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测细胞稳定性的方法，包括细胞样品，其特征在于：所述细胞样品包括经细胞功能、细胞异变、细胞稳定性能三个方面的检测，其中当细胞增殖效果良好、细胞不发生迁移行动、细胞活力>80%、细胞早期及晚期凋亡比例≤10%、细胞自噬比例＜5%、细胞无原癌基因显著表达；细胞核型分析为染色体数目和形态无异变；细胞粘附指标：2h内有明显粘附即可；细胞毒性指标≤10%、细胞衰老比例占比≤20%和细胞倍增时间＜48小时的细胞为稳定细胞；若其中一项指标没有达到标准，则为细胞传代不稳定，中止细胞培育进程。
2.根据权利要求1所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：具体步骤如下：
3.根据权利要求1或2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述细胞样品包括原代细胞、生物工程改造细胞和永生化细胞。
4.根据权利要求1或2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述细胞来源包括人、鼠、猪、鸡、牛和羊。
5.根据权利要求2中所述的一种检测细胞稳定性的方法，其特征在于：所述步骤（3）细胞稳定性能的检测中，细胞核型分析包括以下步骤：通过秋水仙素进行染色体核型分析测定细胞染色体的异位突变情况，然后将所述细胞与x-gal底物混合进行反应，再通过观察是否生成深蓝色产...
【专利技术属性】
技术研发人员：王守伟，杨峰，郭晨，刘文婷，李莹莹，李石磊，唐铎，祁宇，郭翔，刘屹森，赵鹏飞，胡海娟，李畅，任文佳，付周，梁小娟，李宇轩，
申请(专利权)人：中国肉类食品综合研究中心，
类型：发明
国别省市：
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