【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物应用，涉及到一株能够降解高浓度木质纤维素来源抑制物的菌株及其活力维持方法，该菌株有极大潜力应用于木质纤维素生物炼制的脱毒过程。
技术介绍
1、木质纤维素生物炼制通常包括预处理、糖化、脱毒和发酵等过程。预处理可打破木质纤维素生物质天然的致密结构，有利于后续的酶水解。但预处理过程中会产生大量微生物生长抑制物，主要包括木糖过度降解产生的糠醛、葡萄糖过度降解产生的5-羟甲基糠醛、以及半纤维素乙酰基水合释放出的乙酸等。
2、通常来说，提高预处理强度能显著提高酶水解得率，但同时也会增加抑制物的生成。此外一些工农业废弃物，如糠醛生产副产品玉米芯残渣，也含有高浓度抑制物(乙酸含量超过5％，w/w)。这些抑制物会严重抑制后续发酵菌株的正常生长和代谢，因此这些生物质如果需要进行后续的生物转化，必须采用有效的脱毒手段去除其中的抑制物。
3、采用特定的微生物可以对木质纤维素水解液中的抑制物进行去除。相比于物理和化学方法，生物脱毒具有反应条件温和、能耗低、毒性副产物少、选择性高等优点。但现有的生物脱毒菌株仍难以满足对高强度预处理原料和糠醛渣原料中抑制物的有效去除。例如，唐传生物科技有限公司的张厚瑞等人(cn 101735958、cn 102010833)公开了一种在半纤维素水解液中培养东方伊萨酵母或西方伊萨酵母来进行糠醛和乙酸的部分降解，但降解能力有限，且只能在预处理液(半纤维素水解液)中进行。武汉科技大学左振宇等人(cn118086415 a)公开了一种使用皮状丝孢酵母对生物质水解液进行生物脱毒的方法，但皮状
4、110713939b)进一步发现的可对多种木质纤维素来源抑制物进行完全降解的野生型生物脱毒菌株宛氏拟青霉fn89(paecilomyces variotii fn89)，仅能实现对低浓度混合抑制物的降解(糠醛仅0.1g/l、乙酸仅4.0g/l)。现有的生物脱毒菌株必须采用有效的手段提高其抑制物耐受性，才有可能实现对含有高浓度抑制物生物质有效的生物脱毒，促进其生物转化。
5、公开与该技术背景部分中的信息仅旨在增加对本专利技术背景的总体理解，而不应被视为以任何形式承认或暗示该信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、鉴于上述所报道生物脱毒菌株的不足，本专利技术以从含有高浓度抑制物的工业玉米芯糠醛渣中分离得到的一株宛氏拟青霉(paecilomyces variotii)为出发菌株，在含有高浓度混合抑制物的培养基中经过长达70代(共210天)的适应性进化后，获得了一株稳定代谢高浓度混和抑制物的进化菌株，命名为宛氏拟青霉zw70(paecilomyces variotiizw70)。相比于以前的生物脱毒菌株，该菌株代谢高浓度混合木质纤维素来源抑制物的能力更强。为了避免菌株经长期使用或保藏后活力退化，方法中还同时建立了菌株的活化方法，保证了其在工业应用中长期使用时代谢高浓度抑制物能力的稳定性。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、首先从工业玉米芯来源糠醛渣原料中分离得到了一株对木质纤维素原料具有一定降解能力的丝状真菌。经its序列鉴定为宛氏拟青霉(paecilomyces variotii)。随后在含有抑制物的合成培养基中对该菌株经过长周期的适应性进化，最终了获得具有稳定降解高浓度木质纤维素来源抑制物的脱毒菌株宛氏拟青霉zw70(paecilomyces variotiizw70)。鉴于脱毒菌株在长期使用后或在冰箱长期冻存后极易造成脱毒性能的退化，
4、本专利技术上述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌，经its序列比对后，鉴定为宛氏拟青霉paecilomyces variotii。
5、进一步，所述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌的长周期的适应性进化方法，包括如下步骤：
6、(1)孢子液制备：将野生型宛氏拟青霉在pda平板划线，37℃下培养4天，产生大量灰黄色孢子；使用0.05％(w/w)tween 80清洗平板并收集孢子液，用于后续传代培养；孢子液浓度为108-109个/ml；
7、(2)长周期进化所用培养基的制备：基础培养基中含有2g/l kh2po4,1g/l(nh4)2so4,1g/l mgso4·7h2o,1g/l yeast extract,0.5g/l cacl2和15g/l葡萄糖；进化过程共分为五个阶段，在不同阶段向培养基中添加不同浓度的乙酸、5-羟甲基糠醛和糠醛混和抑制物，第一阶段乙酸5g/l、5-羟甲基糠醛0.5g/l、糠醛0.5g/l；第二阶段乙酸7.0g/l、5-羟甲基糠醛1.0g/l、糠醛0.5g/l；第三阶段乙酸9.0g/l、5-羟甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；第四阶段乙酸11.0g/l、5-羟甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；第五阶段乙酸15.0g/l、5-羟甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；
8、(3)长周期适应期进化：宛氏拟青霉孢子液按照1％(v/v)的比例接种到100ml第一阶段进化培养基中，初始ph调节至4.5，37℃，300rpm培养3天；随后按照10％(v/v)接种量连续传代70次；
9、(4)单菌落分离：传代培养液在pda平板经划线分离，得到单菌落。
10、本专利技术所述的一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年8月28日，保藏编号为cctcc m 20241863。
11、本专利技术还提供所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，包括以下几点：
12、(1)活化所用培养基的制备：在pda培养基中加入培养基中含有2g/l kh2po4,1g/l(nh4)2so4,1g/l mgso4·7h2o,1g/l yeast extract,0.5g/l cacl2，15g/l葡萄糖，15.0g/l乙酸、1.5g/l 5-羟甲基糠醛和0.5g/l糠醛，制备成活化用固体平板；
13、(2)菌种活化：使用接种环直接刮取保藏在冰箱的平板、甘油种、或长期使用的菌种，在活化培养平板上划线，在37℃下培养3-5天，每次挑取较大单菌落进行划线传代培养3次。
14、(3)经传代培养活化后的进化菌株仍可以实现在合成培养基和木质纤维素水解液中对高浓度抑制物的高效降解。
15、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，首先从含有高浓度抑制物的工业玉米芯来源糠醛渣原料中分离得到了一株对木质纤维素原料具有一定降解能力的丝状真菌；随后在含有抑制物的合成培养基中对该菌株经过长周期的适应性进化，最终了获得具有稳定降解高浓度木质纤维素来源抑制物的脱毒菌株。
2.根据权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，所述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌，经ITS序列比对后，鉴定为宛氏拟青霉Paecilomyces variotii。
3.一种权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，所述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌的长周期的适应性进化方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求1所述的一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年8月28日，保藏编号为CCTCCM20241863。
5.一种权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持
6.权利要求5所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，所述方法还包括：(1)生物脱毒种子液培养：真菌孢子覆盖的传代平板上加入10mL的0.05％(v/v)Tween 80水溶液，然后用灭菌的细胞涂布棒刮取、收集孢子液；将1mL孢子液接种到100mL不含抑制物的真菌基础培养基中，在37℃恒温和300rpm转速下培养24小时；
7.权利要求6所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，步骤(1)中基础培养基中含有2g/L KH2PO4,1g/L(NH4)2SO4,1g/L MgSO4·7H2O,1g/L yeast extract,0.5g/L CaCl2和15g/L葡萄糖。
8.权利要求6所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，所述质纤维素原料包括但不限于秸秆、木屑、玉米芯糠醛渣等常见木质纤维素原料。
9.权利要求6所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，步骤(2)中脱毒条件为28-48℃、200-750rpm、0.5-2.0vvm。作为优选，其培养条件为37℃、750rpm转速、1vvm通气量。
10.一种权利要求2所述的分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌的长周期的适应性进化方法，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，首先从含有高浓度抑制物的工业玉米芯来源糠醛渣原料中分离得到了一株对木质纤维素原料具有一定降解能力的丝状真菌；随后在含有抑制物的合成培养基中对该菌株经过长周期的适应性进化，最终了获得具有稳定降解高浓度木质纤维素来源抑制物的脱毒菌株。
2.根据权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，所述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌，经its序列比对后，鉴定为宛氏拟青霉paecilomyces variotii。
3.一种权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，其特征在于，所述分离自工业玉米芯来源糠醛渣原料的丝状真菌的长周期的适应性进化方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求1所述的一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年8月28日，保藏编号为cctccm20241863。
5.一种权利要求1所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，包括以下几点：
6.权利要求5所述一株降解高浓度木质纤维来源抑制物的生物脱毒菌株代谢高抑制物的活力维持方法，其特征在于，所述方...
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