【技术实现步骤摘要】
本公开属于蛋白纯化领域，具体的涉及一种单克隆抗体的纯化方法。
技术介绍
1、c-c趋化因子受体8蛋白(ccr8)特异性高表达于人肿瘤组织的treg细胞表面，抗ccr8抗体可清除肿瘤组织中的treg细胞，不清除正常组织中的treg细胞，具有很好的安全性；同时可以阻断ccl1/ccr8通路，与pd-1/pd-l1联用预期可提高肿瘤患者的药物响应率，增强肿瘤免疫。
2、抗人ccr8的单克隆抗体j06为申请人自主研发的cho细胞表达的创新靶点单克隆抗体药物。该单克隆抗体完整分子由2条重链(heavy chain,hc)和2条轻链(light chain,lc)组成，每条重链由453个氨基酸残基组成；每条轻链由219个氨基酸残基组成。
3、上述抗人ccr8的单克隆抗体j06可以阻断ccl1/ccr8通路，与pd-1/pd-l1联用预期可提高肿瘤患者的药物响应率，以增强肿瘤免疫。由于ccr8在肿瘤浸润的调节性t细胞(treg)上特异性高表达，通过结合肿瘤部位treg细胞表面的ccr8，启动adcc特异性的清除肿瘤组织中的treg细胞，因此具有很好的安全性。
4、抗人ccr8的单克隆抗体j06在表达过程中产生了大量的工艺相关杂质(如宿主细胞蛋白残留、外源性dna残留等)和产品相关杂质(高分子量物质(hmws)、低分子量物质(lmws)、电荷异构体等)。这些杂质给下游纯化工作带来了巨大的挑战。传统的三步层析，亲和捕获+初步纯化+精细纯化，虽然能够达到去除杂质和相关残留标准的目的。但由于杂质含量高，层析步骤多，
技术实现思路
1、本公开提供了一种两步层析法纯化抗人ccr8的单克隆抗体j06的纯化方法。
2、专利技术详述
3、1、术语
4、本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
5、在下文详细描述本公开前，应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
6、本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本公开的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本公开的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
7、当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。
8、本文所用的术语“抗体”，典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(h)多肽链和两条轻(l)多肽链的y型四聚蛋白。天然igg抗体即具有这样的结构。每条轻链包含一个轻链可变结构域(vl)和一个轻链恒定结构域(cl)。每条重链包含一个重链可变结构域(vh)和一个重链恒定结构域(ch)(或称为重链恒定区(ch))。
9、术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
10、术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、完整的胞外结构域(ecd)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ecd部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的dna可以是基因组的或非基因组的(例如，cdna)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ecd。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
11、术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“kd”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、elisa、分析超速离心和流式细胞术等。
12、术语“生物学活性”指抗体结合抗原并导致可测量的生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。
13、术语“稳定的”制剂是这样的制剂，其中的蛋白质在保存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。优选地，该制剂在保存后基本上保持其物理和化学稳定性，以及其生物学活性。一般基于制剂保质期来选择贮存期。用来测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域已有的。可以在选定的温度下测量稳定性持续选定的时间。稳定性能够以许多不同的方式进行定性和/或定量地评估，包括评估聚集物形成(例如利用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过肉眼观察)；通过利用阳离子交换层析或毛细管分区电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；sds-page分析以比较减小的和完整的抗体；肽图谱分析；评估生物学活性或抗体的抗原结合功能；等等。不稳定性可以包括下列的任一种或多种：聚集，脱酰胺作用(例如asn脱酰胺作用)，氧化作用(例如met氧化作用)，异构化作用(例如asp异构化作用)，剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，未配对的半胱氨酸，n-末端延伸，c-末端加工，糖基化作用差异，等等。
14、术语“稳定剂”表示药学可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于糖，氨基酸，多元醇，环糊精等。
15、生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中能够熟知和获得，如冷泉港的《抗体实验技术指南》，5-8章和15章。
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中分别用淋洗液1和淋洗液2洗涤杂蛋白，再用洗脱液等梯度洗脱，收集洗脱峰；淋洗液1成分为：50mmol/L Tris，0.2mol/L～0.6mol/L Arg-HCl，pH8.1±0.5；淋洗液2成分为：25mmol/L Tris-HCl，pH8.3±0.5；洗脱液成分为10mmol/L～50mmol/L NaAc-HAc，pH 3.4±0.4。
4.如权利要求2-3任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中亲和洗脱峰样品用2mol/L HAc调pH至3.5±0.3，室温孵育1～4小时结束后用1mol/L Tris调pH至5.3±0.5。
5.如权利要求2-4任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用MerckA1HC深层过滤器对样品进行深层过滤，载量≤5000g/m2；所述步骤(4)中层析柱用25mmol/LNaAc-HAc，pH5.3±
6.如权利要求2-5任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(5)中样品先过Pro Shield预过滤膜；再过Pro Device纳滤膜；纳滤膜ProDevice载量小于5000g/m2。
7.如权利要求2-6任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(6)中样品浓缩、置换缓冲液所选膜包为Merck超滤膜包；置换缓冲液为8～12mmol/L HAc-NaOH,7％～11％蔗糖，pH 5.0±0.5；样品原液浓度最终控制在20g/L±2g/L；样品原液中添加的辅料为终浓度0.03％～0.07％聚山梨酯80。
8.如权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述抗人CCR8的单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示；优选的，所述抗人CCR8的单克隆抗体重链的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链的序列如SEQ ID NO:10所示。
9.权利要求1-8任一项所述的纯化方法获得的抗人CCR8的单克隆抗体。
10.权利要求9所述的抗人CCR8的单克隆抗体在制备用于治疗晚期实体瘤的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中分别用淋洗液1和淋洗液2洗涤杂蛋白，再用洗脱液等梯度洗脱，收集洗脱峰；淋洗液1成分为：50mmol/l tris，0.2mol/l～0.6mol/l arg-hcl，ph8.1±0.5；淋洗液2成分为：25mmol/l tris-hcl，ph8.3±0.5；洗脱液成分为10mmol/l～50mmol/l naac-hac，ph 3.4±0.4。
4.如权利要求2-3任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中亲和洗脱峰样品用2mol/l hac调ph至3.5±0.3，室温孵育1～4小时结束后用1mol/l tris调ph至5.3±0.5。
5.如权利要求2-4任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用mercka1hc深层过滤器对样品进行深层过滤，载量≤5000g/m2；所述步骤(4)中层析柱用25mmol/lnaac-hac，ph5.3±0.5溶液平衡后将样品进行上样。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙波，贾国栋，张世超，张守雨，董道英，张斌，邢婷婷，杨勇，安振明，孙丽霞，李高，
申请(专利权)人：齐鲁制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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