【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种脂肪酶a突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、南极假丝酵母脂肪酶a（ candida antarcticalipase a，简称cala）在脂肪酶研究领域中具有独特的地位，因其对甘油三酯的sn-2位点具有明显的偏好性而备受关注。这种特殊的选择性使其在生物催化过程中具有重要应用价值。与其他类型的脂肪酶相比，cala具有以下几个显著的优点：（1）温度稳定性：cala在高温条件下仍能保持其活性，这使得它在工业应用中更为稳定；（2）底物特异性：cala能够有效水解甘油三酸酯，特别是反式不饱和脂肪酸，这在食品工业和生物燃料生产中具有重大前景；（3）化学选择性：cala对氨基具有高度的化学选择性，使其在氨基酸及其衍生物的不对称合成中发挥关键作用。除了上述优点之外，cala还表现出与南极假丝酵母脂肪酶b（ candida antarcticalipase b，简称calb）相似的特性，如高温稳定性和对有机溶剂的耐受性。然而，cala在界面活性方面的表现更为突出，这为其在工业应用中提供了更大的潜力。
2、甘油二酯（diacylglycerol，简称dag）是一种重要的脂质分子，由甘油与两个游离的脂肪酸分子通过酯化反应形成，或者是由甘油三酯（triacylglycerol，简称tag）中的一个脂肪酸分子被羟基取代而得到。dag存在两种不同的立体构型：1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯。近年来的研究发现，相比于1,2-甘油二
3、但现有的野生型假丝酵母脂肪酶a在制备1,3-甘油二酯时，存在催化活性差、对甘油三酯的sn-2位点的选择性差等问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种脂肪酶a突变体及其制备方法和应用。用于解决现有的野生型假丝酵母脂肪酶a在制备1,3-甘油二酯时，存在催化活性差、对甘油三酯的sn-2位点的选择性差等问题。
2、具体地，本专利技术通过理性设计，对来源于南极假丝酵母（ candida antarctica）的脂肪酶a进行定点突变，得到催化活性和对甘油三酯的sn-2位点的选择性显著提高的南极假丝酵母脂肪酶a（cala）突变体，并且在制备1,3-甘油二酯时，该cala突变体能显著提高1,3-甘油二酯的产量。
3、在一些实施方案中，本专利技术提供了一种脂肪酶a，其氨基酸序列如seq id no: 1所示。
4、本专利技术提供的上述脂肪酶a可以是天然、重组或合成的活性多肽，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主（例如大肠杆菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中产生的产物。
5、在一些实施方案中，上述脂肪酶a是通过将含有其编码基因的重组载体导入表达宿主（例如毕赤酵母gs115）中得到重组基因工程菌株，然后将该重组基因工程菌株进行培养，并进行诱导表达，得到脂肪酶a。
6、在一些实施方案中，本专利技术提供一种编码上述脂肪酶a的核酸分子，其核苷酸序列如seq id no: 2所示。
7、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
8、在第一方面，本专利技术提供了一种脂肪酶a突变体，脂肪酶a突变体是在如seq idno: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点：第94位、117位、121位、122位、283位、431位进行一个或几个氨基酸残基的变化得到的蛋白质；其中，变化选自取代、缺失、添加中的至少一种。
9、在一些实施方案中，脂肪酶a突变体是在如seq id no: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点的突变：1）e94w；2）v117l；3）l121i；4）d122y；5）f283w；6）f431g。
10、在一些实施方案中，脂肪酶a突变体为氨基酸序列如seq id no: 3、seq id no:5、seq id no: 7、seq id no: 9、seq id no: 11、seq id no: 13所示的蛋白质。
11、本专利技术中，氨基酸序列如seq id no: 3所示的脂肪酶a突变体为e94w（脂肪酶a第94位中的谷氨酸(glu)突变为色氨酸(trp)）；氨基酸序列如seq id no: 5所示的脂肪酶a突变体为v117l（脂肪酶a第117位中的缬氨酸(val)突变为亮氨酸(leu)）；氨基酸序列如seqid no: 7所示的脂肪酶a突变体为l121i（脂肪酶a第121位中的亮氨酸(leu)突变为异亮氨酸(ile)）；氨基酸序列如seq id no: 9所示的脂肪酶a突变体为d122y（脂肪酶a第122位中的天冬氨酸(asp)突变为酪氨酸(tyr)）；氨基酸序列如seq id no: 11所示的脂肪酶a突变体为f283w（脂肪酶a第283位中的苯丙氨酸(phe)突变为色氨酸(trp)）；氨基酸序列如seqid no: 13所示的脂肪酶a突变体为f431g（脂肪酶a第431位中的苯丙氨酸(phe)突变为甘氨酸(gly)）。
12、在一些实施方案中，上述脂肪酶a突变体中，除了在第94位、117位、121位、122位、283位、431位中的至少一个位点发生上述突变之外，其进一步可以在其他位点上具有氨基酸的保守取代，使得突变后的氨基酸比如seq id no:1所示的野生型脂肪酶a具有更高的催化效率。优选地，氨基酸的保守取代保留本专利技术脂肪酶a突变体的较高的催化效率。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。最常见的氨基酸互换有氨基酸g至a；a至g、s；v至i、l、a、t、s；i至v、l、m；l至i、m、v；m至l、i、v；p至a、s、n；f至y、w、h；y至f、w、h；w至y、f、h；r至k、e、d；k至r、e、d；h至q、n、s；d至n、e、k、r、q；e至q、d、k、r、n；s至t、a；t至s、v、a；c至s、t、a；n至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种脂肪酶A突变体，其特征在于，所述脂肪酶A突变体是在如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点：第94位、117位、121位、122位、283位、431位进行一个或几个氨基酸残基的变化得到的蛋白质；
2. 根据权利要求1所述的脂肪酶A突变体，其特征在于，所述脂肪酶A突变体是在如SEQID NO: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点的突变：
3. 根据权利要求2所述的脂肪酶A突变体，其特征在于，所述脂肪酶A突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQID NO: 13所示的蛋白质。
4.编码权利要求1-3中任一项所述的脂肪酶A突变体的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自如下任一所示的核酸分子：
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求4或5所述的核酸分子或权利要求6所
8.一种脂肪酶A突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求1-3中任一项所述的脂肪酶A突变体、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的制备方法制备得到的脂肪酶A突变体在制备1,3-甘油二酯中的应用。
10.一种1,3-甘油二酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1. 一种脂肪酶a突变体，其特征在于，所述脂肪酶a突变体是在如seq id no: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点：第94位、117位、121位、122位、283位、431位进行一个或几个氨基酸残基的变化得到的蛋白质；
2. 根据权利要求1所述的脂肪酶a突变体，其特征在于，所述脂肪酶a突变体是在如seqid no: 1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点的突变：
3. 根据权利要求2所述的脂肪酶a突变体，其特征在于，所述脂肪酶a突变体为氨基酸序列如seq id no: 3、seq id no: 5、seq id no: 7、seq id no: 9、seq id no: 11、seqid no: 13所示的蛋白质。
4.编码权利要求1-3中任一项...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚平，马立新，刘阳，饶犇，王娟，李阳，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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