【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传转化，更具体地说，本专利技术涉及一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法。
技术介绍
1、茄子是世界范围内广泛种植的重要蔬菜作物，但是由于茄子栽培种的遗传基础狭窄且种间群体构建困难等原因，很难利用常规育种实现优异性状的快速高效聚合，茄子的遗传转化体系仍不成熟且基因型依赖性强，在一定程度上限制了茄子分子育种和基础理论研究等的进程，目前关于茄子生物育种技术发展相对薄弱，能够快速、准确得到稳定遗传性状的优良品种尤其困难。本专利技术旨在通过发根农杆菌作为介导途径，将外源目的基因快速准确稳定地转化整合到茄子基因组中，该毛状根转化系统可用于茄子基因编辑体系效率的评价，为茄子基因功能研究和生物育种提供新的途径，是茄子稳定遗传转化的重要补充。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的实施例提供一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因遗传转化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、步骤a1：外源质粒转化发根农杆菌感受态细胞；
4、步骤a2：农杆菌菌落pcr的验证；
5、步骤a3：茄子催芽与播种；
6、步骤a4：侵染液的制备；
7、步骤a5：发根农杆菌侵染茄子幼苗；
8、步骤a6：毛状根的诱导；
9、步骤a7：阳性植株的鉴定。
10、步骤a1：发根农杆菌感受态细胞转化的步骤具体为采用热激法将表
11、步骤a11：将-80℃超低温冰箱中取出保存的农杆菌感受态，于室温或在手中片刻待其部分融化，处于冰水混合物状态时插入冰中；
12、步骤a12：每50μg的感受态加入0.5μg质粒dna，用手轻轻拨打管底使其混匀；依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
13、步骤a13：加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃摇床200r/min震荡培养2-3h；
14、步骤a14:将摇浑浊的菌液6000r离心1min收集菌体，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3d。
15、步骤a2：农杆菌菌落pcr目的基因验证方法具体为：
16、步骤a21：将转化完成的农杆菌挑取单菌落，在含有相应抗生素的lb培养基中划短线，置于28℃培养箱48h；
17、步骤a22：农杆菌菌落pcr扩增反应所用试剂总体积为20μl，其反应体系包含2×rapid taq master mix10μl、primer f 0.8μl、primer r 0.8μl、ddh2o 7.4μl、dna 1μl；
18、步骤a23：含有35s-ruby载体验证引物序列包含上游引物primer f：tgtgaacatggtggagca；下游引物primer r：tgaatcttggcgaggttg;
19、步骤a24：含有dsred（rfp）载体验证引物序列包含上游引物primer f：taagggatgacgcacaat；下游引物primer r：cctacaggaacaggtggtg
20、步骤a25：pcr反应步骤为95℃预变性3min、95℃变性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸15sec，返回95℃变性15sec进行35次循环、72℃终延伸5min、4℃保存；
21、步骤a26：琼脂糖凝胶电泳具体步骤为：量取100ml 1×tae 电泳缓冲液向其中加入1g琼脂糖粉，加热沸腾至完全溶解，加入10µl核酸染料（10000×），混匀倒入模具中，凝固后待用；将凝固好的凝胶放入盛有1×tae电泳缓冲液的电泳槽中，与目的条带匹配的marker加入点样孔作为对照，pcr产物按顺序加入后面的点样孔中；150v，400ma电泳20min；凝胶成像分析仪检测结果。
22、步骤a27：蘸取步骤a21中划线长出的单菌落为模板，阳性对照以载体质粒为模板，阴性对照中加入1μl无菌水，加入步骤a24所示引物，配置步骤a22所示20μl反应体系，通过步骤a25所示pcr扩增循环，结束后取10μl pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
23、步骤a28：挑取阳性单克隆菌株，放入含相应抗生素的yep液体培养基，在28℃、200rpm摇床中震荡培养，培养完成后，吸取1ml菌液，加入约150ml左右灭菌的甘油，于-80℃超低温冰箱保存甘油菌。
24、步骤a3：茄子催芽与播种。方法具体为：将供试茄子种子放入两层滤纸中间，置于培养皿中，用400ppm赤霉素润湿滤纸，将培养皿置于30℃培养箱中催芽12-48h，待种子露白后，直接播种在装有基质的穴盘中，置于植物光照培养室内培养。幼苗生长至两片子叶时用于后续侵染试验。
25、步骤a4：侵染液的制备。
26、优选的，侵染也制备具体步骤如下：
27、步骤a41:菌株活化：将-80℃冰箱保存的甘油菌在含有相应抗生素的yep固体培养基上均匀涂布后倒置活化培养2d，用无菌的枪头挑取单菌落接种于500μl yep液体培养基中，28℃、200r min-1振荡培养12h；
28、步骤a42:侵染液制备：吸取100μl活化的菌液接种于100ml yep液体培养基中继续过夜振荡培养，待菌液od600值为0.8时，集菌后重悬于缓冲液，静置3h后备用。
29、步骤a5：含目的基因的发根农杆菌侵染茄子幼苗。
30、优选的发根农杆菌侵染步骤具体为：
31、步骤a51：制备mes侵染液，mes缓冲液包括10mm mgcl2、10mm mes、100μm乙酰丁香酮，ph调整为5.7，过滤除菌，集菌后重悬；
32、步骤a52:菌液浸泡法：在幼苗根茎处将主根系剪除，随后幼苗切口浸入活化菌液中，超声波处理60s，浸入深度3cm左右，浸染时间30min。
33、步骤a6：毛状根的诱导。
34、优选的毛状根诱导方法具体为：
35、步骤a61：侵染后将幼苗移栽到基质中，使用基质覆盖侵染部位；
36、步骤a62：在覆土后向基质中浇灌1ml菌液；
37、步骤a63：盖上育苗盘透明保湿罩，在黑暗条件下共培养2d；
38、步骤a64：共培养结束后转移至正常光照条件下培养，注意定期喷水保湿（禁止在托盘中大量浇水）。
39、步骤a7：阳性植株的鉴定方法具体为：培养30d后统计成功诱导出的毛状根的株数，计算转化率。
40、转化率=（带有阳性根的植株数/侵染植株总数）×100%
41、本专利技术的技术效果和优点：
42、1、发根农杆菌（ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤A1中，发根农杆菌感受态细胞转化的步骤具体为采用热激法将表达载体质粒转入农杆菌感受态细胞（K599)中，具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤A2中，农杆菌菌落PCR目的基因验证方法具体为：
4.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤A3茄子催芽与播种方法具体为：将供试茄子种子放入两层滤纸中间，置于培养皿中，用400ppm赤霉素润湿滤纸，将培养皿置于30℃培养箱中催芽12-48h，待种子露白后，直接播种在装有基质的穴盘中，置于植物光照培养室内培养，幼苗生长至两片子叶时用于后续侵染试验。
5.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤A4侵染液的制备，具体步骤如下
6.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤A5中，含目的基因的发根农杆菌侵染茄子幼苗的步骤具体为：
7.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：
8.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤a1中，发根农杆菌感受态细胞转化的步骤具体为采用热激法将表达载体质粒转入农杆菌感受态细胞（k599)中，具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤a2中，农杆菌菌落pcr目的基因验证方法具体为：
4.根据权利要求1所述的一种基于发根农杆菌介导的茄子毛状根转基因的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤a3茄子催芽与播种方法具体为：将供试茄子种子放入两层滤纸中间，置于培养皿中，用400ppm赤霉素...
【专利技术属性】
技术研发人员：李强，魏健，常玉诺，陈雪平，罗双霞，李丽，宋利军，张志硕，张巍巍，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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