【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒及提取方法，属于生物诊断。
技术介绍
1、近年来，癌症的早期诊断与个性化治疗日益受到重视。循环肿瘤细胞和游离核酸作为液体活检的重要组成部分，能为肿瘤的早期筛查、疗效监测及预后评估提供宝贵信息。相较于传统的组织活检，液体活检具有创伤小、便于重复采样和实时监测等优势，尤其适用于监测转移性癌症和评估治疗效果。
2、目前，从微量血浆样本(＜1ml)中提取循环肿瘤核酸或游离核酸的技术逐渐成为研究的热点。然而，现有的提取方法在灵敏度、特异性和操作便捷性等方面仍存在局限性。大多数方法依赖于较大体积(≥2ml)的样本，且提取过程繁琐，耗时较长，导致在临床应用中的效率受到限制。此外，血浆中的游离核酸浓度较低，如何在保持高纯度的前提下快速提取足量的核酸仍然是一个技术挑战。
3、现有技术也公开了一些血浆游离核酸提取试剂盒，例如中国专利申请cn107663521a、cn114058616a、cn115386576a、cn116904442a和cn117947018a中，均公开了血浆游离核酸提取试剂盒或试剂组合，但是现有技术中存在如下不足：试剂盒或试剂组合中涉及溶液太多，包含有蛋白酶k或者sds十二烷基硫酸钠。另外，现有技术的提取方法，需要进行额外加热、冰浴或孵育等过程，操作复杂，影响检测效率。
4、综上，开发一种高效、快速且灵敏的从微量血浆样本中提取循环肿瘤核酸或游离核酸的方法具有重要的临床意义。这不仅能够提升液体活检方法的应用价值，还能推动肿瘤
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒及提取方法。本专利技术旨在探索一种快速、灵敏、特异地提取循环肿瘤核酸或游离核酸的方法。本专利技术的试剂组合或试剂盒，用磁珠法进行提取，搭配样本处理液、漂洗液、洗脱液，其中样本处理液相当于裂解液及第一漂洗液，即包含裂解功能和漂洗功能，漂洗液相当于第二漂洗液，省略使用蛋白酶k或者sds十二烷基硫酸钠。本专利技术的提取方法，可以在室温下进行，无额外加热、冰浴和孵育等过程，连贯性强，操作步骤简单。
2、本专利技术解决技术问题的技术方案如下：
3、在本专利技术的第一方面，提供一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒。
4、本专利技术的试剂组合或试剂盒中，包括如下成分：样本处理液、漂洗液、磁珠和洗脱液；
5、所述样本处理液的主要成分为：异硫氰酸胍、尿素、tris-hcl、edta、nacl、tween-20、trition-100、硫酸铵和异丙醇；
6、所述漂洗液的主要成分为：tris-hcl和无水乙醇。
7、所述洗脱液的主要成分为水。
8、优选地，所述样本处理液的主要成分为：1-5m异硫氰酸胍、1-5m尿素、10-100mmtris-hcl、10-100mm edta、10-200mm nacl、10-200mm硫酸铵、10％-30％异丙醇、1％-10％trition-100和0.01％-1％ tween-20。更优选地，所述样本处理液的主要成分为：5m异硫氰酸胍、2m尿素、20mm tris-hcl、10mm edta、100mm nacl、0.05％tween 20、150mm硫酸铵、5％triton-100和20％异丙醇。
9、优选地，所述漂洗液的主要成分为：0.1-0.5m tris-hcl和75％-90％无水乙醇。更优选地，所述漂洗液的主要成分为：0.15m tris-hcl和80％无水乙醇。
10、优选地，所述磁珠为二氧化硅修饰的磁珠。更优选地，磁珠粒径小于1um，磁珠液中磁珠含量不低于20mg/ml。推荐使用磁珠粒径800nm，磁珠固含量20mg/ml，表面有二氧化硅基团修饰的磁性微球。
11、优选地，所述洗脱液的主要成分为无酶水。更优选地，所述洗脱液包括10mm edta和无酶水。
12、本专利技术的试剂组合或试剂盒中的各个组分作用如下：
13、样本处理液中，异硫氰酸胍的作用是裂解微量样本的血红蛋白等，尿素的作用包括溶解、结合及沉降蛋白，tris-hcl、edta、nacl的作用是作为缓冲体系，为提取提供一个稳定的溶液环境，tween-20、trition-100的作用包括作为表面活性剂沉降蛋白，并稳定核酸结构，异丙醇的作用是辅助小分子核酸与磁珠的结合，并溶解一些杂质。
14、漂洗液中，tris-hcl的作用是作为缓冲体系，提供一个稳定的溶液环境，无水乙醇的作用是溶解一些有机蛋白等杂质及样本处理液中的组分。
15、磁珠的作用是与核酸分子结合。
16、洗脱液的主要成分为水。
17、在本专利技术的第二方面，提供了利用如第一方面所述的试剂组合或试剂盒从微量血浆样本中快速提取游离核酸的方法，此方法是非疾病诊断目的。
18、本专利技术的方法，包括如下步骤：取分离的微量血浆样本，向其中加入样本处理液和磁珠，震荡混匀，让微量血浆中的血红蛋白等充分裂解(因为样本处理液中含有大量盐粒子，让蛋白变性)，并促进样本中的游离核酸与磁珠结合(此时与磁珠结合的除了血浆中的游离核酸还存在部分蛋白杂质等)。随后将含有磁珠的混合液置于磁力架上，去除上清后，再次加入样本处理液与磁珠混合，此时样本处理液的作用除了让磁珠与核酸结合，也具有溶解结合在磁珠表面的杂质的作用(因为样本处理液中含醇，可溶解一些有机杂质，即漂洗去除杂质)。然后再用漂洗液对磁珠进行两次漂洗，彻底去除杂质后，利用洗脱液，可将结合在磁珠表面的游离核酸洗脱下来。
19、本专利技术具有如下技术效果：
20、1)本专利技术提供了一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒及提取方法。本专利技术的试剂组合或试剂盒只需4种组分，包括：样本处理液、漂洗液、磁珠和洗脱液。样本处理液可使得血浆样本中的蛋白等物质沉降，并促进游离核酸与磁珠结合，另外因样本处理液中含醇，可溶解一些杂质，即在裂解结合过程结束后，利用样本处理液除去结合在磁珠表面的杂质。再对磁珠进行两次漂洗液漂洗，彻底去除杂质后，利用洗脱液，将磁珠表面的游离核酸洗脱下来。利用本专利技术提取微量血浆样本中的游离核酸，操作简便、效率高，试剂组合少，更经济，可实现自动化，且获得的核酸中抑制物含量低、有利于下游实验分析。
21、2)利用本专利技术的试剂组合或试剂盒及提取方法提取微量血浆样本中的游离核酸，操作简便、效率高，试剂组合少，更经济，可实现自动化。相较于竞品建库不稳定导致个别样本建库浓度低；加入蛋白酶k消化后操作时间长、且建库产物平均浓度低；本专利技术中使用的样本处理液兼具裂解与漂洗功能，且相比含乙醇类漂洗液效果更好；与手动柱式法提取相比，本专利技术方法可实现全自动化，提高了实验效率。
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1.一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述的试剂组合或试剂盒中，包括如下成分：样本处理液、漂洗液、磁珠和洗脱液；
2.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述样本处理液的主要成分为：1-5M异硫氰酸胍、1-5M尿素、10-100mM Tris-HCl、10-100mM EDTA、10-200mM NaCl、10-200mM硫酸铵、10％-30％异丙醇、1％-10％Trition-100和0.01％-1％Tween-20。
3.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述漂洗液的主要成分为：0.1-0.5M Tris-HCl和75％-90％无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述磁珠为二氧化硅修饰的磁珠。
5.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述洗脱液的主要成分为无酶水。
6.根据权利要求2所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述样本处理液的主要成分为：5M异硫氰酸胍、2M尿素、20mM Tris-HCl、10mM
7.根据权利要求3所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述漂洗液的主要成分为：0.15M Tris-HCl和80％无水乙醇。
8.根据权利要求4所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述磁珠粒径小于1um，磁珠液中磁珠含量不低于20mg/mL。
9.根据权利要求5所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括10mM EDTA和无酶水。
10.利用如权利要求1-9任意一项所述的试剂组合或试剂盒从微量血浆样本中快速提取游离核酸的方法，此方法是非疾病诊断目的，其特征在于，所述的方法，包括如下步骤：取分离的微量血浆样本，向其中加入样本处理液和磁珠，震荡混匀，让微量血浆中的血红蛋白等充分裂解，并促进样本中的游离核酸与磁珠结合；随后将含有磁珠的混合液置于磁力架上，去除上清后，再次加入样本处理液与磁珠混合；然后再用漂洗液对磁珠进行两次漂洗，彻底去除杂质后，利用洗脱液，将结合在磁珠表面的游离核酸洗脱下来。
...【技术特征摘要】
1.一种用于从微量血浆样本中快速提取游离核酸的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述的试剂组合或试剂盒中，包括如下成分：样本处理液、漂洗液、磁珠和洗脱液；
2.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述样本处理液的主要成分为：1-5m异硫氰酸胍、1-5m尿素、10-100mm tris-hcl、10-100mm edta、10-200mm nacl、10-200mm硫酸铵、10％-30％异丙醇、1％-10％trition-100和0.01％-1％tween-20。
3.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述漂洗液的主要成分为：0.1-0.5m tris-hcl和75％-90％无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述磁珠为二氧化硅修饰的磁珠。
5.根据权利要求1所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述洗脱液的主要成分为无酶水。
6.根据权利要求2所述的试剂组合或试剂盒，其特征在于，所述样本处理液的主要成分为：5m异硫氰酸胍、2m尿素、20mm tris-hcl...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛丰，肖欢欢，黄一新，曾祥，殷剑峰，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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