【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵菌种制备，具体为一种丁酸梭菌冻干粉及其制备方法。
技术介绍
1、丁酸梭菌(clostridium butyricum)又名酪酸菌，隶属于厚壁菌门(firmicutes)芽孢杆菌科(bacillaceae)梭菌属(clostridium)，是一种严格厌氧、可产生孢子的革兰氏阳性菌，其代谢产物丁酸、乙酸、丙酸以及各种消化酶等可修复损伤的肠道黏膜及调节肠道微生态环境，有益于动物健康及生长发育，是理想的饲料用抗生素替代品。
2、为了便于将丁酸梭菌应用于营养保健、食品、医药等产品的生产中，通常以液体培养基发酵的方式来使丁酸梭菌增殖，获得较高活菌数的菌体，然后经干燥得到益生菌菌粉，常规的热风干燥因过高的致死率而不适用于丁酸梭菌的干燥，因此，丁酸梭菌通常采用冷冻干燥的方式制备菌粉。然而，在冷冻干燥的过程中，细胞冷冻产生的冰晶会破坏细胞膜而使得丁酸梭菌同样存在一定的活菌损失，此外，在丁酸梭菌的商品货架期，处于常温保存条件下，丁酸梭菌以活菌形态保持在商品中，也会因自身的生长耗尽营养或者因环境温度过高而死亡，会导致丁酸梭菌在货架期活菌数量衰减速度过快，商品出售时其丁酸梭菌的活菌数量不能达到商品标签中标注的含量，从而出现质量问题，因此，如何提供一种丁酸梭菌冻干粉，以实现对丁酸梭菌的简易保藏和延长保藏时间的同时避免菌种退化，是目前亟需解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种丁酸梭菌冻干粉及其制备方法
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种丁酸梭菌冻干粉，所述冻干粉的原料包括丁酸梭菌菌液、载体、冻干保护剂和分散稳定剂，所述载体、冻干保护剂和分散稳定剂的质量之比为5：5：1，所述丁酸梭菌菌液的活菌数＞2×109cfu/g。
5、优选的，所述载体为可溶性淀粉(50g/l)。
6、通过上述技术方案，载体限定了具体种类和具体浓度，能保证丁酸梭菌能够稳定存在于载体上。
7、优选的，所述冻干保护剂包括蔗糖(40g/l)、甘露醇(8g/l)、半胱氨酸(1g/l)、维生素c(1g/l)。
8、通过上述技术方案，冻干保护剂限定了的具体种类和具体浓度，能减少低温冻结对丁酸梭菌细胞的损伤。
9、优选的，所述分散稳定剂包括羧甲基纤维素钠(10g/l)。
10、通过上述技术方案，分散稳定剂的设置，可以使得丁酸梭菌能够分散均匀的同时稳定存在。
11、本专利技术还提供一种丁酸梭菌冻干粉的制备方法，其检测步骤如下：
12、s1：将实验室-80℃保存的丁酸梭菌菌种取出，以1％的接种量接种至梭菌增殖培养基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸钠3.0g/l、氯化钠5.0g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l)中，37℃厌氧培养24h，得到菌种悬液；
13、s2：将菌种悬液按照体积比为5％的接种量接种于一级梭菌增殖培养基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸钠3.0g/l、氯化钠5.0g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l)中，在厌氧培养箱37℃条件下厌氧培养24h，得到一级菌种培养液；
14、s3：将一级菌种培养液按体积比为5％的接种量接种于二级梭菌增殖培养基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸钠3.0g/l、氯化钠5.0g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l)中，在厌氧培养箱37℃条件下厌氧培养24h，得到二级菌种培养液；
15、s4：将二级菌种培养液按体积比为5％的接种量接种于三级梭菌增殖培养基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸钠3.0g/l、氯化钠5.0g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l)中，在厌氧培养箱37℃条件下厌氧培养24h，得到三级菌种培养液；
16、s5：将三级丁酸梭菌培养液按照体积比为5％的接种量接种于梭菌发酵培养基(牛肉膏33.1g/l、蛋白胨32.7g/l、可溶性淀粉24.2g/l、碳酸钙24.7g/l、七水硫酸镁0.25g/l、一水硫酸锰0.25g/l、发酵专用消泡剂1.0g/l)中，在37℃下搅拌10min，在厌氧培养箱37℃条件下厌氧培养24h。培养过程中每间隔2h搅拌5min，每间隔6h取样进行革兰氏染色观察，芽孢应为直杆状，两端钝圆，革兰氏染色呈阳性；同时利用分光光度计测定od值，当活菌数大于2×109cfu/g时即代表丁酸梭菌已培养至对数期，此时即可获取丁酸梭菌菌液；
17、s6：向丁酸梭菌菌液中加入可溶性淀粉(50g/l)，并进行混合，得到混合物，随后分别于水中溶解蔗糖(40g/l)、甘露醇(8g/l)、半胱氨酸(1g/l)、维生素c(1g/l)、羧甲基纤维素钠(10g/l)，后加入到混合物中进行混合，并进行冷冻离心(转速为5500rpm，时间为25min)，得到丁酸梭菌菌泥；
18、s7：对丁酸梭菌菌泥进行平衡(温度为37℃，时间为50min)，然后进行预冷冻(温度为-40℃，时间为12h)，然后进行真空冷冻干燥(温度≤-40℃，真空度为6pa，时间为22h)，得到丁酸梭菌冻干粉。
19、s8：将制备好的丁酸梭菌冻干粉按梯度兑水活化，活化半小时后震匀，用移液枪吸取100μl到梭菌选择培养基上涂板，置于37℃下厌氧培养16h，观察菌落生长情况。此外，试验同步设立一个丁酸梭菌原液对照组，该组不添加任何添加剂，与活化后的冻干粉进行菌落生长能力对比。
20、与现有技术相比，本专利技术提供了一种丁酸梭菌冻干粉及其制备方法，具备以下有益效果：
21、(1)本专利技术实施例提供的一种丁酸梭菌冻干粉，其活菌数大于2×109cfu/g，含水率小于2％，且芽孢处于休眠状态，因此有利于菌种长时间的保藏，且菌种在保藏过程中不会发生退化，也就不会影响代本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述冻干粉的原料包括丁酸梭菌菌液、载体、冻干保护剂和分散稳定剂，所述载体、冻干保护剂和分散稳定剂的质量之比为5：5：1，所述丁酸梭菌菌液的活菌数＞2×109cfu/g。
2.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述载体为可溶性淀粉(50g/L)。
3.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述冻干保护剂包括蔗糖(40g/L)、甘露醇(8g/L)、半胱氨酸(1g/L)、维生素C(1g/L)。
4.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述分散稳定剂包括羧甲基纤维素钠(10g/L)。
5.根据权利要求1-4所述的一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于，其制备方法步骤如下：
【技术特征摘要】
1.一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述冻干粉的原料包括丁酸梭菌菌液、载体、冻干保护剂和分散稳定剂，所述载体、冻干保护剂和分散稳定剂的质量之比为5：5：1，所述丁酸梭菌菌液的活菌数＞2×109cfu/g。
2.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌冻干粉，其特征在于：所述载体为可溶性淀粉(50g/l)。
3.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟凯旋，冷敦鹏，李金香，夏伟，臧学运，冷敦雁，苗越，齐慧东，
申请(专利权)人：青岛中仁动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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