【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于优化编码基因，具体地涉及一种重组人i型胶原蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、胶原是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，约占总蛋白的30%。目前在脊椎动物体内已发现至少28种胶原，它们具有组织分布特异性，是与生物体组织器官的形成、衰老和疾病有关的功能性蛋白。按照胶原是否能形成纤维进行分类，可将所有胶原分为成纤维胶原（fibril-forming collagen）和非成纤维胶原（non-fibril-forming collagen）两大类，其中成纤维胶原包括i、ii、iii、v、xi、xxiv和xxvii型胶原。i型胶原是最普遍存在的胶原，约占动物体内胶原总量的90%，占总蛋白质量的将近20%。人i型胶原是由αl(i)和α2(i)两种不同α链构成的异相三聚体[αl(i)]2α2(i)。
2、i型胶原具有优良的止血和组织修复能力，已经广泛应用于医疗、美容等领域。i型胶原主要采用动物提取的方式获得。但是动物提取胶原存在批间一致性差、水溶性差、存在病毒传播风险等问题。通过重组表达的方式获得重组胶原能够很好地解决上述问题。胶原蛋白的重组表达一般采用全长表达、片段表达和小片段重复的几种方式。全长表达比较困难，一般表达量很低，难以实现规模化生产；而片段和小片段重复较容易表达，且可筛选到高表达菌株，实现产业化。但是并不是任意随机的片段就可以实现表达，大多序列的表达量很低，或者根本不表达。因此，重组胶原序列的设计是重组胶原制备的关键。
3、有鉴于此，找到一种能够高表达，并且
技术实现思路
1、本专利技术通过不同的序列设计和筛选工作，提供一种高表达，并具有良好细胞活性的重组人i型胶原蛋白，并同时提供其制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
3、本专利技术一方面提供了一种重组人i型胶原蛋白，所述重组胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
4、（1）其氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
5、mhhhhhhgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagp；
6、（2）其氨基酸序列如在seq id no.1的基础上取代、缺失或添加一个或几个氨基酸修改后的氨基酸序列；
7、（3）与seq idno:1所示氨基酸序列具有大于80％同一性的氨基酸序列。
8、另一方面，本专利技术提供了一种编码上述重组人i型胶原蛋白的核酸，所述重组人i型胶原蛋白的核苷酸序列包含如下特征中的一种或多种：
9、（1）其核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：
10、atgggggtaaaaggagaagctggtctacccggaaccccgggtccaacgggtccggcaggtcagaaaggcgaaccgggttctgatggtatcccgggcagcgcaggcgaaaagggcgagccgggcctcccgggacgcggtttcccgggtttcccgggcgcgaaaggcgacaaaggcagcaagggcgaggtgggcttcgacggtcgtaatggtgagaagggtgaaaccggtgcgcctggtctgaaaggcgagaatggcttgccgggcgagaacggcgcgccgggcccgatgggtccgcgtggtgcgccaggtgagcgcggtagaccgggccttccgggcgctgccggcgcgcgtggcggggcgggctccctgggtgccggtggcgcgtttggtgaagcagcgggtgaccgtggtccgtacggcaccgatattggtccgggcggtggttatggtgccgctgctgaaggtggtatgtacgcgggaaacggcggtttgctgggtgcggattttgctggcgacctggattataacgaactggcacatcatcaccaccaccatcactaa。
11、（2）对（1）进行同义密码子替换得到的任意一种核苷酸序列。
12、再一方面，本专利技术提供了一种载体，所述载体含有seq id no.2所示的核苷酸序列。
13、再一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述载体。
14、再一方面，本专利技术提供了上述重组人i型胶原蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
15、（1）蛋白序列设计
16、根据人i型胶原蛋白，设计如seq no.1所示的氨基酸序列；
17、（2）基因设计和合成
18、根据步骤（1）中所述的重组人i型胶原蛋白的氨基酸序列反向设计编码核酸序列，并进行密码子优化，得到编码重组人i型胶原蛋白的核苷酸序列，然后进行基因合成，得到编码所述重组人i型胶原蛋白片段的核酸片段；
19、（3）表达载体的构建：
20、通过ndei和ⅹhoi多克隆位点连接到pet30a(+)质粒上，得到表达质粒；
21、（4）表达菌株的构建和筛选：
22、将步骤（3）中所述质粒通过热激法转入宿主细胞感受态中，涂布在含有卡那霉素的抗性板上，培养，获得表达菌株；
23、（5）诱导表达
24、对步骤（4）得到的表达菌株进行诱导表达，收集菌液；
25、（6）纯化
26、对步骤（5）收集的菌液进行菌体破碎和离心、亲和层析、离子交换层析、脱盐、冻干后得到重组人i型胶原蛋白冻干品。
27、作为本专利技术的一些优选实施方案，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
28、再一方面，本专利技术提供了一种上述重组人i型胶原蛋白在医疗器械领域的用途。
29、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
30、（1）本专利技术提供的重组人i型胶原蛋白具有[a1] 形成凝胶。
31、（2）本专利技术提供的重组人i型胶原蛋白，经实验验证，具有较佳的促细胞迁移、促细胞增殖和促细胞粘附性能。
32、（3）本专利技术的重组人i型胶原蛋白制备方法产量高，适于工业化大规模生产。
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1.一种水溶性重组人I型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组人I型胶原蛋白的核酸，其特征在于，所述重组人I型胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体。
5.一种制备如权利要求1所述的水溶性重组人I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种如权利要求1所述的水溶性重组人I型胶原蛋白在制备医药产品、医疗器械、生物材料、组织工程、化妆品中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种水溶性重组人i型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组人i型胶原蛋白的核酸，其特征在于，所述重组人i型胶原蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兰举，齐磊，于月欣，
申请(专利权)人：河北纳科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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