【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽用生物制品检验，尤其涉及一种a型产气荚膜梭菌间接血凝检测方法的建立及其应用。
技术介绍
1、产气荚膜梭菌（clostridium perfringens），又称魏氏梭菌，存在于很多健康动物的肠道中，当饲养和环境条件改变时，可引起畜禽的产气荚膜梭菌病，一旦发病，会导致畜禽迅速死亡，病程极短，往往在未得到有效治疗前便死亡。自产气荚膜梭菌发现以来，在各个地区的畜禽中出现了一种病程短、发病急、死亡快、死亡率高的疾病（产气荚膜梭菌病），且该病的症状有时不明显，往往在发病治疗之前，畜禽便开始死亡，给畜牧养殖业造成了不可估量的经济损失。
2、因此对于该病主要以疫苗预防为主。目前，对于动物免疫疫苗后效力检测方法主要为血清中和法和免疫攻毒法。其中，血清中和法需要大量试验动物且对操作者的技巧要求较高，需要洁净级动物试验房，不适用于牧场临时检验样品。而免疫攻毒法需要靶动物进行试验，经济成本较高，且操作不方便。
3、间接血凝试验（iha）是血清学检测中的经典方法，经过不断改进后，已广泛用于检测各种病原的血清抗体，与血清中和法相比，间接血凝试验操作过程简便、节约时间和实验动物、且成本低。
4、因此，如何建立一种可用于a型产气荚膜梭菌疫苗效力检验的间接血凝试验方法成为本领域亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、首先，本专利技术提供了一种抗原致敏红细胞悬液的制备方法，包括：
2、用a型产气荚膜梭菌制备外毒素溶液，制得免疫原；所述a型产气荚膜梭菌的
3、将红细胞悬液与戊二醛混合后，醛化2~4h，以制得醛化红细胞悬液；再将所述醛化红细胞悬液进行鞣酸化，制得醛化-鞣酸化的红细胞悬液；
4、将所述免疫原与所述醛化-鞣酸化的红细胞悬液混合，以制得抗原致敏红细胞悬液。
5、本领域在制备致敏红细胞时，通常采用的免疫原为纯化后的蛋白，但是由于蛋白的纯化方法复杂、纯化条件苛刻，不易纯化获得符合致敏红细胞要求的蛋白。而本专利技术发现，采用上述a型产气荚膜梭菌制备的外毒素溶液，可以直接作为免疫原致敏红细胞，省去蛋白纯化步骤。
6、进一步，本专利技术发现，在采用上述a型产气荚膜梭菌的外毒素溶液作为免疫原致敏红细胞时，需要在红细胞醛化过程中控制醛化时间在2~4h，时间过长则间接血凝试验孔全部自凝，出现假阳性，时间过短则红细胞破碎较多，醛化红细胞保存时间缩短。
7、更优选地，醛化时间为2.5~3h。
8、优选地，醛化的温度为4℃~25℃。
9、在一些实施方案中，将所述a型产气荚膜梭菌接种厌气肉肝胃酶消化汤培养基中，于36~37℃静置培养4~5小时后收获菌液，离心后用0.22μm滤膜过滤，将滤液用4~6kd中空纤维浓缩18~22倍，制得所述外毒素溶液（免疫原）。
10、在一些实施方案中，制得所述免疫原后，稀释成不同滴度后注射小鼠，根据小鼠致死情况获得小鼠最小致死量。
11、优选地，所述免疫原的毒力为每毫升含620~630个小鼠最小致死量（mld）。
12、在一些实施方案中，所述红细胞悬液中的红细胞来源于绵羊血。
13、在一些实施方案中，醛化红细胞悬液的浓度为4%~6%。
14、在一些实施方案中，醛化-鞣酸化的红细胞悬液的浓度为4%~6%。
15、在一些实施方案中，所述抗原致敏红细胞悬液的浓度为1.5%~2.5%。
16、在一些实施方案中，采用阳性血清、阴性血清测定抗原致敏单位，以最少量的抗原致敏红细胞与相应的阳性血清出现最高效价的凝集作为1个致敏单位，且抗原致敏红细胞无自凝或者破裂现象。
17、在一些实施方案中，将含1~2个致敏单位的所述免疫原与4%~6%的醛化-鞣酸化红细胞悬液混合，以制得抗原致敏红细胞悬液。
18、进一步，本专利技术提供了上述任一方案所制得的抗原致敏红细胞悬液。
19、进一步，本专利技术提供了一种a型产气荚膜梭菌间接血凝试验法的建立方法，包括：
20、使用不同外毒素含量的权利要求1所述的免疫原致敏所述醛化-鞣酸化的红细胞悬液，测定同一a型产气荚膜梭菌阳性血清的最高血清效价，确定最高血清效价所对应的抗原稀释度，并建立a型产气荚膜梭菌间接血凝试验法。
21、在一些实施方案中，所述a型产气荚膜梭菌阳性血清的制备方法包括：
22、用a型产气荚膜梭菌制备外毒素溶液，然后将所述外毒素溶液进行灭活脱毒后制得a型产气荚膜梭菌类毒素溶液，而后将所述a型产气荚膜梭菌类毒素溶液制备成a型产气荚膜梭菌类毒素灭活疫苗；再将所述灭活疫苗免疫动物，分离血清，制得所述a型产气荚膜梭菌阳性血清。
23、优选地，采用氢氧化铝胶作为佐剂制备a型产气荚膜梭菌类毒素灭活疫苗。
24、进一步，本专利技术提供了所述的抗原致敏红细胞悬液、或所述的建立方法在血清中和抗体效价检测中的应用。
25、在一些实施方案中，所述应用包括：
26、将所述a型产气荚膜梭菌外毒素溶液制备成最高血清效价所对应的抗原稀释度的抗原溶液，致敏所述醛化-鞣酸化的红细胞悬液，然后加入待测血清反应，根据红细胞凝集情况判断血清中和抗体效价。
27、在一些实施方案中，所述反应的条件为在室温条件下反应45~60min；
28、或所述反应的条件为在35~39℃条件下反应30~45min。
29、在一些实施方案中，所述最高血清效价所对应的抗原稀释度为140~160个小鼠最小致死量毒素/ml。
30、在一些实施方案中，间接血凝效价(nlog2)的计算方法为：
31、
32、进一步，本专利技术提供了所述的抗原致敏红细胞悬液、或所述的建立方法、或所述的应用在a型产气荚膜梭菌疫苗效力检验中的应用。
33、在一些实施方案中，通过定量确定间接血凝效价与血清中和抗体效价之间的相关性后，采用所述a型产气荚膜梭菌间接血凝试验法对a型产气荚膜梭菌疫苗的效力进行检验。
34、在一些实施方案中，中和抗体效价大于等于6的血清间接血凝抗体效价大于等于5。
35、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
36、本专利技术采用a型产气荚膜梭菌外毒素溶液作为免疫原，以a型产气荚膜梭菌外毒素抗原最小致死量为依据，通过筛选间接血凝试验中抗原最佳稀释度，建立了一种敏感性、特异性和符合率好的a型产气荚膜梭菌间接血凝试验法，采用该试验法检测疫苗免疫动物血清的间接血凝效价，能够代替免疫攻毒法以及血清中和法应用于a型产气荚膜梭菌疫苗的效力检验中。
37、本专利技术的方法特异性强，敏感性好，符合率高；而且操作简单，不需要特殊设备，结果判断直观，肉眼可观，能快速检测，适合在基层工作中推广。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种抗原致敏红细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原致敏红细胞悬液的浓度为1.5%~2.5%。
3.一种抗原致敏红细胞悬液，其特征在于，其由权利要求1或2所述的制备方法制得。
4.一种A型产气荚膜梭菌间接血凝试验法的建立方法，其特征在于，包括：
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述A型产气荚膜梭菌阳性血清的制备方法包括：
6.权利要求1或2所述的制备方法、或权利要求3所述的抗原致敏红细胞悬液、或权利要求4或5所述的建立方法在血清中和抗体效价检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应的条件为在室温条件下反应45~60min；
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述最高血清效价所对应的抗原稀释度为140~160个小鼠最小致死量毒素/mL。
10.权利要求1或2所述的制备方法、或权利要求3所述的抗原致敏红细胞悬液、或权利要求4
...【技术特征摘要】
1.一种抗原致敏红细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原致敏红细胞悬液的浓度为1.5%~2.5%。
3.一种抗原致敏红细胞悬液，其特征在于，其由权利要求1或2所述的制备方法制得。
4.一种a型产气荚膜梭菌间接血凝试验法的建立方法，其特征在于，包括：
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述a型产气荚膜梭菌阳性血清的制备方法包括：
6.权利要求1或2所述的制备方法、或权利要求3所述的抗原致敏红细胞悬液、或权利要求4或...
【专利技术属性】
技术研发人员：王婷，韩四娥，李化生，金鹰，郝颖，杨富贵，史文瑞，王岩，张娜，刘丽春，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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