【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及(+)-吉马烯a高产基因元件、基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、温郁金(curcuma wenyujin y.h.chen et c.ling)为姜科姜黄属植物，主产于浙江温州瑞安等南部地区，具有疏肝解郁、行气祛瘀、利胆退黄的治疗功效。现代药理研究表明，温郁金具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化等药理活性，其主要活性成分是挥发油和姜黄素类化合物，我国研究人员于1981年首次发现其抗肿瘤活性成分为β-榄香烯。β-榄香烯是一种不含环氧基、硝基、蒽环、苯环等有毒基团的倍半萜类化合物，主要积累在温郁金的块茎中，对肺癌、肝癌、喉癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌和膀胱癌等多种肿瘤细胞具有明显的治疗作用，注射用榄香烯乳剂已成功用于临床治疗，可显著提高生存率和肿瘤反应，降低体内生物毒性，在抗肿瘤药物领域具有良好的应用前景。
2、萜类化合物是自然界中含量最丰富、种类最多的次生代谢产物，来源于两个c5结构单元：异戊烯焦磷酸(ipp)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)。在植物中产生ipp和dmapp有两种途径：甲羟戊酸(mva)途径和甲基赤藓糖醇磷酸盐(mep)途径。2分子ipp和1分子dmapp缩合形成倍半萜的共同前体化合物法尼基焦磷酸(fpp)，fpp在倍半萜合酶的催化下生成结构各异的倍半萜化合物。酿酒酵母因具有遗传背景清楚，较强的mva代谢途径，自身产生的次生代谢有限，以及可以表达细胞色素p450为酶蛋白提供合适的下游修饰作用等优势，被视为理想的萜类异源合成微生物平台。
3、天然来源的吉马烯a存在两种手性异构体，分别存在于植物和微生物中，且这两种异构体在自然条件下不能发生转化。在目前的报导中，β-榄香烯的异源合成研究存在微生物来源和植物来源吉马烯a合成酶混用的现象，这导致了吉马烯a及其重排产物β-榄香烯绝对构型的混乱，而成药的β-榄香烯为提取自温郁金的(-)-β-榄香烯。药物的手性异构体通常是无效的甚至有强烈毒副作用的，因此，合成正确构型的药物分子对其进一步开发和利用至关重要。
4、公开号为cn115975893a的中国专利文献公开了一种产β-榄香烯的工程菌及应用，该专利技术利用大肠杆菌escherichia coli为宿主，构建了β-榄香烯异源生物合成工程菌，通过宿主细胞、培养基的优化提高前体fpp的供应，并对关键酶吉马烯a合成酶的筛选和突变改造，使在大肠杆菌中生物合成β-榄香烯的产量提高到了126.39mg/l；公开号为cn117363503a的中国专利文献公开了一种产吉马烯a/β-榄香烯基因工程菌及其构建方法和应用，该专利技术以酵母scheffersomyces segobiensis为宿主菌株，异源表达莴苣吉马烯a合酶ltc2基因以及过表达羟甲基戊二酰单酰辅酶a还原酶hmgr基因得到；所述ltc2基因来源于外源植物莴苣；该专利技术利用木糖生产β-榄香烯，β-榄香烯的产量达到98.27mg/l。但是上述专利技术中，β-榄香烯的产量均有待进一步提高。
技术实现思路
1、为了构建高效异源生产(-)-β-榄香烯的微生物细胞工厂，本专利技术首先鉴定β-榄香烯关键前体物质吉马烯a的绝对构型，并基于(+)-吉马烯a合成酶突变体提供了一种(+)-吉马烯a高产基因元件，构建高效的异源合成(-)-β-榄香烯的基因工程菌。
2、具体采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种(+)-吉马烯a高产基因元件，所述的(+)-吉马烯a高产基因元件是将(+)-吉马烯a合成酶突变体与酿酒酵母内源fpp合成酶erg20通过连接肽连接得到的融合蛋白；
4、所述的(+)-吉马烯a合成酶突变体是由来自菊科植物菊苣(cichorium intybus)的野生型吉马烯a合成酶在如seq id no.1所示的氨基酸序列中进行以下任意一种突变：r354h；d343s；i126v；q289a；s386t；r354h且d343s；r354h且i126v；r354h且q289a；r354h且s386t；r354h且d343s且s386t；r354h且d343s且i126v；r354h且i126v且s386t；
5、erg20的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、优选的，所述的(+)-吉马烯a合成酶突变体为cigaslor354h-i126v-s386t，是由来自菊科植物菊苣(cichoriumintybus)的野生型吉马烯a合成酶在如seq id no.1所示的氨基酸序列中进行r354h且i126v且s386t的突变；所述的连接肽选自gggs，所述的融合蛋白为erg20-gggs-cigaslor354h-i126v-s386t。
7、经研究发现，(-)-β-榄香烯关键前体物质吉马烯a的绝对构型为(+)-吉马烯a，通过改造获得了上述(+)-吉马烯a合成酶突变体，其中cigaslor354h-i126v-s386t的催化活性最高，进一步将(+)-吉马烯a合成酶突变体与酿酒酵母内源fpp合成酶erg20通过连接肽连接得到的融合蛋白后，表达erg20-gggs-cigaslor354h-i126v-s386t的菌株(-)-β-榄香烯产量更高。
8、本专利技术还提供了编码所述的(+)-吉马烯a高产基因元件的基因，优选的，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9、本专利技术还提供了一种包含所述的基因的表达载体。
10、本专利技术还提供了一种表达所述的(+)-吉马烯a高产基因元件的基因工程菌。
11、进一步的，所述的基因工程菌以酿酒酵母为底盘细胞，还进行了如下基因改造中的至少一种：
12、(1)弱化erg9表达，同时敲除或沉默rox1、ypl062w和yjl064w；
13、(2)过表达thmg1、erg20、idi和upc2.1；
14、(3)过表达thmg1、erg10、erg8、erg19、erg12和erg13。
15、本专利技术同时采取多种调控策略合理改造适合倍半萜化合物生物合成的酿酒酵母底盘细胞，并将(+)-吉马烯a高产基因元件构建到底盘细胞中，形成高效的异源合成(-)-β-榄香烯的微生物细胞工厂。
16、本专利技术还提供了所述的(+)-吉马烯a高产基因元件、编码所述的(+)-吉马烯a高产基因元件的基因或表达所述的(+)-吉马烯a高产基因元件的基因工程菌在生产(+)-吉马烯a或(-)-β-榄香烯中的应用。
17、本专利技术还提供了一种合成(+)-吉马烯a或(-)-β-榄香烯的方法，利用所述的基因工程菌。
18、本专利技术还提供了所述的基因工程菌在医药或化工领域中的应用。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
20、本专利技术鉴定了(-)-β-榄香烯关键前体物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.(+)-吉马烯A高产基因元件，其特征在于，所述的(+)-吉马烯A高产基因元件是将(+)-吉马烯A合成酶突变体与酿酒酵母内源FPP合成酶ERG20通过连接肽连接得到的融合蛋白；
2.根据权利要求1所述的(+)-吉马烯A高产基因元件，其特征在于，所述的(+)-吉马烯A合成酶突变体为CiGASloR354H-I126V-S386T，是由来自菊科植物菊苣(Cichoriumintybus)的野生型吉马烯A合成酶在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中进行R354H且I126V且S386T的突变；所述的连接肽选自GGGS，所述的融合蛋白为ERG20-GGGS-CiGASloR354H-I126V-S386T。
3.编码权利要求1或2所述的(+)-吉马烯A高产基因元件的基因。
4.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体。
5.一种表达权利要求1或2所述的(+)-吉马烯A高产基因元件的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌以酿酒酵母为底盘细胞，还进行了如下基因改造中的至少一种：
<...【技术特征摘要】
1.(+)-吉马烯a高产基因元件，其特征在于，所述的(+)-吉马烯a高产基因元件是将(+)-吉马烯a合成酶突变体与酿酒酵母内源fpp合成酶erg20通过连接肽连接得到的融合蛋白；
2.根据权利要求1所述的(+)-吉马烯a高产基因元件，其特征在于，所述的(+)-吉马烯a合成酶突变体为cigaslor354h-i126v-s386t，是由来自菊科植物菊苣(cichoriumintybus)的野生型吉马烯a合成酶在如seq id no.1所示的氨基酸序列中进行r354h且i126v且s386t的突变；所述的连接肽选自gggs，所述的融合蛋白为erg20-gggs-cigaslor354h-i126v-s386t。
3.编码权利要求1或2所述的(+)-吉马...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢恬，胡添源，殷晓浦，胡雨涵，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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