【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容总体上涉及以下领域：包含多价阴离子(例如无机聚磷酸根)的核酸(例如dna或rna，特别是mrna或抑制性rna，例如sirna)组合物、用于制备和储存这样的组合物的方法、以及这样的组合物在治疗中的用途。
技术介绍
1、使用重组核酸(例如dna或rna)用于将外来遗传信息递送到靶细胞中是公知的。重组核酸可以以裸形式施用于有此需要的对象；然而，通常使用组合物施用重组核酸。例如，核酸，例如rna，可使用不同递送载剂，主要基于与核酸一起形成纳米粒的阳离子聚合物或脂质来递送至对象。纳米粒旨在保护核酸(例如rna)免于降解，使核酸(例如rna)能够递送至靶位点，以及促进靶细胞的细胞摄取和加工。核酸递送的效率部分取决于纳米粒的分子组成，并可受许多参数影响，包括颗粒尺寸、制剂和电荷或与分子部分(例如聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)或其他配体)的接枝。这样的纳米粒制剂的命运受多种关键因素(例如，纳米粒的尺寸和尺寸分布；等)控制。例如，在2018年的fda“liposome drugproducts guidance”中，这些因素被称为应进行分析和说明的特定属性。使用rna的优点包括瞬时表达和非转化特征。此外，rna不需要进入细胞核来被表达，并且此外rna不能整合到宿主基因组中，因此消除了多种风险例如肿瘤发生。
2、考虑与peg接枝来降低血清相互作用，以提高血清稳定性并延长循环时间，这可有助于某些靶向方法。在靶位点与受体结合的配体可帮助提高靶向效力。此外，聚乙二醇化(pegylation)可用于颗粒改
3、peg是药物递送中最广泛使用且为金标准的“隐形(stealth)”聚合物。peg脂质由于其亲水空间位阻特性(peg壳防止导致聚集的静电或范德华力吸引(van der waalsattraction))因而通常被并入到体系中来制备均匀且胶体稳定的纳米粒群。聚乙二醇化使得能够吸引聚合物周围的水壳，保护颗粒免于血清蛋白的调理作用，提高血清半衰期，这使得改善了药代动力学行为。脂质酰基链(c18、c16或c14)长度的变化改变了在颗粒中peg脂质并入的稳定性，这导致药代动力学的调节。与在体内半衰期<30分钟的lnp解离的包含短(c14)酰基链的peg脂质的使用导致最佳的肝细胞基因沉默效力(chen et al.,2014,j.control release 196:106-12；ambegia et al.,2005,biochimica et biophysicaacta 1669:155-163)。另外，可通过改变peg脂质参数来获得对颗粒尺寸的严格控制：颗粒中较高的peg mw或较高的peg脂质摩尔分数导致较小的颗粒。
4、尽管具有这些优点，但是纳米粒的聚乙二醇化也可导致不利于药物递送的预期用途的数种作用。已知脂质体和lnp的聚乙二醇化降低了细胞摄取和内体逃逸，从而最终降低整体转染效率。实际上，peg壳为颗粒与细胞的有效结合提供了空间屏障，并且还通过阻止脂质体与内体膜之间的膜融合阻碍内体释放。这就是为什么必须始终仔细调整peg脂质的类型和所使用的peg脂质的量。它在一方面应在体内和稳定方面提供足够的隐形作用，同时在另一方面不阻碍转染。该现象被称为“peg窘境(peg dilemma)”。
5、除降低转染效率之外，聚乙二醇化还与由抗peg抗体和/或补体激活以及贮积病(storage disease)诱导的加速血液清除(accelerated blood clearance，abc)现象相关(bendele a et al.,1998,toxicolocical sciences 42,152-157；young ma et al.,2007,translational research 149(6),333-342；s.m.moghimi,j.szebeni,2003,progress in lipid research 42:463-478)。ishida等人和laverman等人报道了，在大鼠中静脉内注射peg接枝的脂质体可显著改变第二剂量(当该第二剂量在间隔数天之后施用时)的药代动力学行为(laverman p et al.,2001,j.pharmacol.exp.ther.298(2),607-12；ishida et al.,2006,j.control release 115(3),251-8)。“加速血液清除”(abc)现象显示出与脂质体的peg含量相关。血浆中抗peg抗体的存在通过单核吞噬细胞系统(monophagocyte system，mps)诱导了更高的颗粒清除，这最终降低了药物的效力。
6、peg还被认为诱导补体激活，所述补体激活可导致超敏反应，也称为补体激活相关的假性变态反应(complement-activation related pseudo-allergy，carpa)。从文献中仍不清楚补体的激活一般是由于纳米粒还是特别是由于peg的存在。
7、其他脂质纳米粒中peg的存在也可诱导特异性免疫应答。semple et al.(2005,j.pharmacol.exp.ther.312(3),1020-6)报道了包含peg脂质衍生物和包封的反义寡脱氧核苷酸或质粒dna的脂质体引发了强烈的免疫应答，其导致小鼠中后续剂量的快速血液清除。该应答的量级足以诱导显著的发病率并且在一些情况下诱导显著的死亡率。从血液中快速消除脂质体包封的寡脱氧核苷酸取决于膜中peg脂质的存在，因为使用非聚乙二醇化的脂质体或包含可快速交换的peg脂质的脂质体消除了该应答。抗peg抗体的产生和假定的补体激活是对囊泡从血液中快速消除的可能解释。
8、由于peg可诱导免疫应答，因此对于需要多次注射的某些应用而言需要避免它。一些实例是使用核酸(例如rna，特别是mrna)进行的例如用于蛋白质替代治疗的治疗。在此本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.组合物，其包含(i)核酸；(ii)可电离出阳离子的脂质；(iii)类固醇；(iv)中性脂质；和(v)无机聚磷酸根。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根包含式[PxO(3x+1)]y，其中x是整数且为至少3；并且y是阴离子电荷。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、六磷酸根、七磷酸根、及其混合物，优选选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、及其混合物，更优选地，所述无机聚磷酸根是三磷酸根。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根是线性无机聚磷酸根，例如线性无机三磷酸根。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中(v)无机聚磷酸根与(ii)可电离出阳离子的脂质的摩尔比为至少约1:2，优选至少约2:3，例如至少约4:3。
6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其基本上不含包含聚乙二醇(PEG)的脂质，优选基本上不含任何包含PEG的化合物，更优选基本上不含PEG。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为约
8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中水是所述组合物中的主要组分和/或所述组合物中包含的除水之外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的渗量浓度为至多约1000×10-3osmol/kg，优选约100×10-3osmol/kg至约500×10-3osmol/kg，更优选约300×10-3osmol/kg。
10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述核酸的浓度为约1mg/l至约500mg/l，例如约1mg/l至约100mg/l、约5mg/l至约100mg/l、或约10mg/l至约100mg/l。
11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质包含含有至少一个叔胺部分的头基。
12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质具有式(X)结构
13.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或可电离出阳离子的脂质具有式(XI)结构：
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约20mol％至约75mol％，例如约40mol％至约70mol％、约45mol％至约65mol％、约50mol％至约60mol％、约20mol％至约40mol％、约25mol％至约40mol％、或约25mol％至约35mol％。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述类固醇包含甾醇，例如胆固醇。
16.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约60mol％，例如约15mol％至约40mol％、约20mol％至约35mol％、约20mol％至约30mol％、约35mol％至约60mol％、约40mol％至约60mol％、或约45mol％至约60mol％。
17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)。
18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质占所述组合物中存在的总脂质的约5mol％至约25mol％，例如约10mol％至约25mol％、约15mol％至约25mol％、约17mol％至约21mol％、约5mol％至约15mol％、或约7mol％至约14mol％。
19.权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约20mol％至约70mol％；所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约60mol％；并且所述中性脂质(例如磷脂)占所述组合物中存在的总脂质的约5mol％至约25mol％。
20.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约40mol％至约70mol％，例如约45mol％至约65mol％、或约50mol％至...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.组合物，其包含(i)核酸；(ii)可电离出阳离子的脂质；(iii)类固醇；(iv)中性脂质；和(v)无机聚磷酸根。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根包含式[pxo(3x+1)]y，其中x是整数且为至少3；并且y是阴离子电荷。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、六磷酸根、七磷酸根、及其混合物，优选选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、及其混合物，更优选地，所述无机聚磷酸根是三磷酸根。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述无机聚磷酸根是线性无机聚磷酸根，例如线性无机三磷酸根。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中(v)无机聚磷酸根与(ii)可电离出阳离子的脂质的摩尔比为至少约1:2，优选至少约2:3，例如至少约4:3。
6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其基本上不含包含聚乙二醇(peg)的脂质，优选基本上不含任何包含peg的化合物，更优选基本上不含peg。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物的ph为约4.0至约8.0，优选约4.5至约8.0，例如约5.0至约8.0、约5.5至约8.0、约6.0至约8.0、约6.5至约8.0、约6.8至约7.9、或约7.0至约7.8。
8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中水是所述组合物中的主要组分和/或所述组合物中包含的除水之外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的渗量浓度为至多约1000×10-3osmol/kg，优选约100×10-3osmol/kg至约500×10-3osmol/kg，更优选约300×10-3osmol/kg。
10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述核酸的浓度为约1mg/l至约500mg/l，例如约1mg/l至约100mg/l、约5mg/l至约100mg/l、或约10mg/l至约100mg/l。
11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质包含含有至少一个叔胺部分的头基。
12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质具有式(x)结构
13.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或可电离出阳离子的脂质具有式(xi)结构：
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约20mol％至约75mol％，例如约40mol％至约70mol％、约45mol％至约65mol％、约50mol％至约60mol％、约20mol％至约40mol％、约25mol％至约40mol％、或约25mol％至约35mol％。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述类固醇包含甾醇，例如胆固醇。
16.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约60mol％，例如约15mol％至约40mol％、约20mol％至约35mol％、约20mol％至约30mol％、约35mol％至约60mol％、约40mol％至约60mol％、或约45mol％至约60mol％。
17.权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)和二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)。
18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质占所述组合物中存在的总脂质的约5mol％至约25mol％，例如约10mol％至约25mol％、约15mol％至约25mol％、约17mol％至约21mol％、约5mol％至约15mol％、或约7mol％至约14mol％。
19.权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约20mol％至约70mol％；所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约60mol％；并且所述中性脂质(例如磷脂)占所述组合物中存在的总脂质的约5mol％至约25mol％。
20.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约40mol％至约70mol％，例如约45mol％至约65mol％、或约50mol％至约60mol％；所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约40mol％，例如约20mol％至约35mol％、或约20mol％至约30mol％；并且所述中性脂质占所述组合物中存在的总脂质的约15mol％至约25mol％，例如约17mol％至约21mol％。
21.权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中类固醇与中性脂质的摩尔比为至多2.5，优选地所述比为1至2.5。
22.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述可电离出阳离子的脂质占所述组合物中存在的总脂质的约20mol％至约40mol％，例如约25mol％至约40mol％、或约25mol％至约35mol％；所述类固醇占所述组合物中存在的总脂质的约35mol％至约60mol％，例如约40mol％至约60mol％、或约45mol％至约60mol％；并且所述中性脂质占所述组合物中存在的总脂质的约5mol％至约15mol％，例如约7mol％至约14mol％。
23.权利要求1至19和22中任一项所述的组合物，其中类固醇与中性脂质的摩尔比为至少3.0，优选地所述比为3.0至10.0，例如5.0至7.0。
24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含分散在水相中的颗粒，其中所述颗粒包含所述核酸的至少一部分、所述可电离出阳离子的脂质的至少一部分、所述类固醇的至少一部分、以及所述中性脂质的至少一部分；并且其中所述无机聚磷酸根的至少一部分与所述颗粒缔合。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述颗粒选自脂质纳米粒(lnp)、脂质体、脂质复合物(lpx)、及其混合物。
26.权利要求24至25中任一项所述的组合物，其中所述颗粒占所述组合物中存在的所述核酸的至少50％，优选至少75％，更优选至少85％。
27.权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物中存在的所述聚磷酸根的至少10％，优选至少20％，并且更优选至少50％与所述颗粒缔合。
28.权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中所述颗粒的尺寸为约30nm至约500nm，例如约50nm至约150nm。
29.权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述核酸是rna，优选mrna。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述rna(1)包含代替尿苷的经修饰核苷，其中所述经修饰核苷优选选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)；(2)具有经密码子优化的编码序列；和/或(3)具有与野生型编码序列相比g/c含量提高的编码序列。
31.权利要求29或30所述的组合物，其中所述rna包含以下中的至少一种，优选以下中的全部：5’帽；5’utr；3’utr；和poly-a序列。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述poly-a序列包含至少100个a核苷酸，其中所述poly-a序列优选为间断的a核苷酸序列。
33.权利要求31或32所述的组合物，其中所述5’帽为帽1或帽2结构。
34.权利要求29至33中任一项所述的组合物，其中所述rna编码一种或更多种多肽，其中优选地所述一种或更多种多肽是药物活性多肽和/或包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
35.权利要求34所述的组合物，其中所述药物活性多肽和/或者所述抗原或表位来源于以下或者为以下：病原体的蛋白质、所述蛋白质的免疫原性变体、或者所述蛋白质或其免疫原性变体的免疫原性片段。
36.权利要求34或35所述的组合物，其中所述药物活性多肽和/或者所述抗原或表位来源于以下或者为以下：sars-cov-2刺突(s)蛋白、其免疫原性变体、或者所述sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
37.权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述组合物为液体形式，优选在约2℃至约10℃的温度下。
38.权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中在储存至少一周之后，优选在约2℃至约8℃的温度下储存至少一周之后，所述组合物的核酸完整性与在储存之前的核酸完整性相比为至少90％。
39.权利要求24至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在储存之后核酸颗粒的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(pdi)基本上等于在储存之前所述核酸颗粒的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。
40.权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述组合物为冷冻形式。
41.权利要求40所述的组合物，其中在将该冷冻组合物解冻之后的核酸完整性与在所述组合物被冷冻之前的核酸完整性相比为至少90％或基本上100％。
42.权利要求40至41中任一项所述的组合物，其中在将该冷冻组合物解冻之后核酸颗粒的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(pdi)基本上等于在所述组合物被冷冻之前所述核酸颗粒的尺寸(z平均值)和/或尺寸分布和/或pdi。
43.制备包含分散在最终水相中的颗粒的组合物的方法，其中所述组合物包含(i)核酸；(ii)可电离出阳离子的脂质；(iii)类固醇；(iv)中性脂质；和(v)无机聚磷酸根；其中所述颗粒包含所述核酸的至少一部分、所述可电离出阳离子的脂质的至少一部分、以及所述类固醇的至少一部分；其中所述无机聚磷酸根的至少一部分与所述颗粒缔合；并且其中所述最终水相包含最终缓冲体系；
44.权利要求43所述的方法，其中步骤(i)还包括选自稀释和过滤的一个或更多个步骤。
45.权利要求43至44中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括：
46.权利要求43至45中任一项所述的方法，其中过滤是透析、切向流过滤或渗滤，优选透析或切向流过滤。
47.权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述无机聚磷酸根或其盐包含或具有式pxo(3x+1)my’，其中x是整数且为至少3；每个m独立地为h+或阳离子；并且y’是电荷平衡所需的阳离子的数目。
48.权利要求47所述的方法，其中每个m独立地选自h+、碱性阳离子、铵和单价有机阳离子，优选地每个m独立地选自h+、na+、k+、li+和nh4+。
49.权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述无机聚磷酸根或其盐选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、六磷酸根、七磷酸根、其盐及混合物，优选选自三磷酸根、四磷酸根、五磷酸根、其盐及混合物，更优选地，所述无机聚磷酸根或其盐是三磷酸根或其盐。
50.权利要求43至49中任一项所述的方法，其中所述无机聚磷酸根或其盐是线性无机聚磷酸根或其盐，例如线性三磷酸根或其盐。
51.权利要求43至50中任一项所述的方法，其中(v)无机聚磷酸根与(ii)可电离出阳离子的脂质的摩尔比为至少约1:2，优选至少约2:3，例如至少约4:3。
52.权利要求43至51中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上不含包含peg的...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯特芬·潘茨纳，戈兰·马丁·哈姆拉兹，
申请(专利权)人：生物技术公司，
类型：发明
国别省市：
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