【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学与生物医学，具体地涉及一种基因工程化的巨噬细胞和制备方法及其应用。
技术介绍
1、多元醇通路(polyol pathway)是糖代谢的一条重要支路，共包含两个步骤：首先在糖醇醛缩酶(aldose reductase,ar)的作用下，利用烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nadph)提供能量，将葡萄糖和半乳糖分别还原为葡萄糖醇或半乳糖醇；之后在葡萄糖醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase，sodh)的作用下，将葡萄糖醇氧化为果糖，同时生成一分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)。多元醇通路对于维持糖类与糖醇类在机体内的稳态尤为重要。机体发生炎症反应的时候，该通路的平衡会被打破(糖类/糖醇类的比例)。例如在l.monocytogenes外伤感染的情况下，成虫果蝇全身裂解液的糖类水平发生了显著的降低。hcv病人的血清以及尿液样本中，同样呈现出了多元醇通路代谢紊乱的现象。在晚期糖尿病人中，也存在着多元醇通路代谢紊乱的现象，同时糖醇类的堆积伴随着局部免疫反应的激活。但是，多元醇通路作为糖代谢的支路之一，何时启动并参与免疫代谢转换，以及如何参与天然免疫的调控还知之甚少。
2、ar属于醛酮还原酶超家族(aldo-keto reductase，akr)，是多元醇通路中的重要限速酶。ar可以还原多种底物，包括醛、醛糖以及糖皮质激素。akr超家族由15个家族组成(akr1-15)，均是各种依赖nadph的氧化还原酶，这些蛋白广泛涉及羰基解毒、前致癌物激活、脂质代谢、细胞癌变和癌症治疗等。人的ar属于akr1b
3、在非病理的情况下，ar的表达情况处于静默或低表达。在受到外界的刺激时，ar的表达量会明显的上调，这与炎症的反应过程密切相关。通过ar抑制剂抑制糖醇类的堆积，能够有效的缓解机体多个部位的炎症反应。
4、然而，迄今为止尚没有一个很好的体外免疫细胞模型，可以为研究多元醇通路对炎症免疫的影响提供一个很好的细胞学研究平台。
5、因此，本领域亟需提供一种研究多元醇通路对炎症免疫的影响的体外免疫细胞模型。
技术实现思路
1、本专利技术的旨在提供一种基因工程化的巨噬细胞，所述基因工程化是研究多元醇通路对炎症免疫的影响的体外免疫细胞模型。
2、在本专利技术的第一方面，提供了一种基因工程化的巨噬细胞，所述基因工程化的巨噬细胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
3、在另一优选例中，所述基因工程化的巨噬细胞具有以下一个或多个特征：
4、(1)与未进行akr1b8基因敲除的巨噬细胞相比，所述基因工程化的巨噬细胞触角比例显著提高；
5、(2)与未进行akr1b8基因敲除的巨噬细胞相比，所述基因工程化的巨噬细胞多元醇通路的代谢产物山梨糖醇含量显著下降；和
6、(3)与未进行akr1b8基因敲除的巨噬细胞相比，所述基因工程化的巨噬细胞早期凋亡显著下降。
7、在另一优选例中，特征(1)中所述的显著提高是指：所述基因工程化的巨噬细胞的触角比例/未经基因敲除的巨噬细胞的触角比例的比值≥3,较佳地≥4。
8、在另一优选例中，特征(2)中所述的显著提高是指：所述基因工程化的巨噬细胞中多元醇通路的代谢产物山梨糖醇浓度c1/未经基因敲除的巨噬细胞中多元醇通路的代谢产物山梨糖醇浓度c0的比值为0.3-0.6。
9、在另一优选例中，特征(3)中所述的显著提高是指：所述基因工程化的巨噬细胞的早期凋亡/未经基因敲除的巨噬细胞的早期凋亡的比值为≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。
10、在另一优选例中，所述基因工程化的巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡具有抵抗性。
11、在另一优选例中，所述的基因工程化的巨噬细胞是敲除或敲低了基因akr1b8的raw264.7细胞。
12、在另一优选例中，所述的敲除是通过用sgrna1和sgrna2进行敲除所获得的细胞系。
13、在本专利技术的第二方面，提供了一种在体外下调巨噬细胞中多元醇代谢通路的方法，所述方法包括步骤：
14、在体外将巨噬细胞中的基因akr1b8敲除，从而获得多元醇代谢通路下调的巨噬细胞。
15、在本专利技术的第三方面，提供了一种在体外提高巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡抵抗性的方法，所述方法包括：
16、在体外将巨噬细胞中的基因akr1b8敲除，从而获得基因工程化的巨噬细胞，其中，与未经基因敲除的巨噬细胞相比，所述基因工程化的巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡具有提高的抵抗性。
17、在另一优选例中，所述基因工程化的巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡的抵抗性与未经基因敲除的巨噬细胞相比较，提高了30％-40％。
18、在本专利技术的第四方面，提供了一种制备如第一方面所述基因工程化的巨噬细胞的方法，所述方法包括步骤：
19、(a)提供待编辑的巨噬细胞；和
20、(b)对所述巨噬细胞进行基因编辑，从而获得第一方面所述的基因工程化的巨噬细胞。
21、在另一优选例中，所述敲除是指将巨噬细胞中的akr1b8基因转录本的第一个外显子切除，得到akr1b8基因敲除的巨噬细胞。
22、在另一优选例中，还包括对基因工程化的巨噬细胞进行稳定传代，从而获得稳定的基因工程化的巨噬细胞系。
23、在本专利技术的第五方面，提供了一种如第一方面所述基因工程化的巨噬细胞的用途，用于：研究多元醇通路对炎症免疫的影响、多元醇通路对巨噬细胞代谢与功能、研究巨噬细胞多元醇通路影响细菌或病毒感染巨噬细胞的分子机制。
24、在本专利技术的第六方面，提供了一种如第一方面所述基因工程化的巨噬细胞的用途，用于构建体外免疫细胞模型。
25、在本专利技术的第七方面，提供了一种用于制备第一方面所述基因工程化的巨噬细胞的试剂组合，所述试剂组合包括：
26、(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：casrx、cpf1、cas9、cas13a、cas13b、cas13c、或其组合；和
27、(b)grna或其表达载体，其中所述grna是引导所述基因编辑蛋白特异性结合akr1b8基因的rna，其中，所述grna的靶向位点序列为sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的靶向核酸序列如seq id no:id no:1所示，所述sgrna2的靶向核酸序列如seq idno:id 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
2.如权利要求1所述基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞具有以下一个或多个特征：
3.如权利要求1所述所述的基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡具有抵抗性。
4.如权利要求1所述所述的基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述的基因工程化的巨噬细胞是敲除或敲低了基因akr1b8的RAW264.7细胞。
5.一种在体外下调巨噬细胞中多元醇代谢通路的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
6.一种在体外提高巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡抵抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：
7.一种制备如权利要求1所述基因工程化的巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对基因工程化的巨噬细胞进行稳定传代，从而获得稳定的基因工程化的巨噬细胞系。
9.一种如权利要求
10.一种如权利要求1所述基因工程化的巨噬细胞的用途，其特征在于，用于构建体外免疫细胞模型。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞中基因akr1b8被敲除或敲低。
2.如权利要求1所述基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞具有以下一个或多个特征：
3.如权利要求1所述所述的基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述基因工程化的巨噬细胞对过氧化氢所诱导的巨噬细胞早期凋亡具有抵抗性。
4.如权利要求1所述所述的基因工程化的巨噬细胞，其特征在于，所述的基因工程化的巨噬细胞是敲除或敲低了基因akr1b8的raw264.7细胞。
5.一种在体外下调巨噬细胞中多元醇代谢通路的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
6.一种在体外提高...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘磊，赵娅娅，张苗苗，李华萍，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：
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