【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种耐有机溶剂的高活性rna切割型脱氧核酶(rna-cleaving dnazyme)的专利技术及其应用。
技术介绍
1、脱氧核酶(dnazyme)是一类人工合成的具有催化功能的核酸分子主要通过体外筛选(in vitro selection)或定向进化(directed evolution)技术从随机dna文库中分离获得。最早的dnazyme是以pb2+离子为辅助因子从随机dna文库筛选获得，在pb2+存在下催化酯交换反应。目前已发现的dnazyme可以催化包括dna或rna的切割、磷酸化或烷基化等多种反应类型。相比于蛋白酶而言，dnazyme具有分子量小，可化学合成且稳定性高，免疫原性低，可在目标物(如金属离子、小分子或大分子等)刺激下发生催化反应产生信号等优势，因此在生物传感、生物治疗、逻辑运算以及分子器件等领域有广阔应用前景。其中，以具有rna切割活性的dnazyme最引人关注，目前基于dnazyme的重金属离子便携式探测器已成功商业化。
2、rna切割型dnazyme由底物链和酶链组成。底物链除了为完整的rna序列外，目前还常用单个rna碱基嵌入到dna序列作为底物来筛选dnazyme，其切割位点通常为rna与dna连接的磷酸二酯键。酶链为dna序列，一般包含催化区域和底物结合臂区域。dnazyme可通过顺式或反式两种模式催化底物切割，前者为dnazyme和底物连接成一个分子，后者为dnazyme和底物分别作为两个独立的分子。目前大多数公开报道的dnazyme在正常生理状态或
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种获得高活性rna切割型dnazyme的筛选文库设计策略、耐有机溶剂的高活性的rna切割型dnazyme及其潜在应用，以解决或改善现有技术中的dnazyme活性不高、难以在含有机溶剂条件下应用等问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供耐有机溶剂的rna切割型dnazyme筛选或设计文库，所述文库基于dnazyme e3p(5’-aagtggtgcccggaaagggtgactc a-底物识别区-3’)构建，包括：在e3p的3’和5’端分别引入若干个碱基作为pc r引物识别区、在可变区域引入随机序列，其中e3p的可变区域是指e3的5’端起第20-26个碱基。
4、在本专利技术的具体实施方式中，所述随机序列的长度为10-60个碱基，优选20-50个碱基，再优选30-50个碱基，最优选40个碱基。
5、在本专利技术的具体实施方式中，所述引物识别区的长度分别为16-19个碱基。
6、在本专利技术的具体实施方式中，5’端引入atacag，3’端引入gtccga，与e3原有的一部分序列一起作为引物识别区域。
7、在本专利技术的具体实施方式中，5’端pcr引物为：5’-atacagaagtggtg ccc-3’；3’端pcr引物为：5’tcggacctatgaactgatg-3’。
8、在本专利技术的具体实施方式中，所述引入是指随机序列插入可变区，或替代可变区的部分或全部碱基。
9、优选地，底物识别区为大于10nt的任意dna序列；优选为5’-tcagttca tag-3’。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述dnazyme筛选或设计文库包括如下序列的核酸分子：5’-atacagaagtggtgcccggaaagggtg-n40-actcatcag ttcataggtccga-3’，其中n40是40个随机碱基。
11、本专利技术第二方面提供耐有机溶剂的切割rna的dnazyme，所述dnazyme包括如下结构：从5’到3’依次包含6nt的5’部分引物识别区，e3p的1-19位的茎环区，e3p的20-26位的可变区，以及任选位于e3p可变区的定向进化区(通过体外筛选从随机文库中获得的序列)，底物识别区，任选的3’部分引物识别区；
12、其中所述酶的的3’端还可以任选地包含1-6个，优选1-3个碱基的截短，5’端1位和2位的碱基可以包含任意突变，所述位置相对于e3p确定；
13、所述定向进化区为：
14、tj11-3定向进化区：gcgctgtgtaacgtgcatggtgagttacgcgcga gatagtac(seq idno.61)；
15、所述e3p的序列为：
16、e3p(5’-aagtggtgcccggaaagg gtga ctca-底物识别区-3’)。
17、在本专利技术的具体实施方式中，所述“位于”的含义为插入可变区，或替代可变区的部分或全部碱基。
18、在本专利技术的具体实施方式中，所述定向进化区替代e3p的21-23位(5’→3’)。
19、在本专利技术的具体实施方式中，所述5’引物识别区为atacag。
20、在本专利技术的具体实施方式中，底物识别区为大于10nt的任意dna序列，优选5’-tcagttcatag-3’。
21、在本专利技术的具体实施方式中，所述dnazyme的5’端与底物连接形成顺式结构。
22、本专利技术第三方面提供耐有机溶剂的rna切割型dnazyme，包括：
23、1)下述表格中的酶：
24、
25、2)在1)中酶的5’端引入atacag；
26、3)在1)中酶的5’端第1位或第2位，第21、22、23、24或25引入任选的突变，其中所述位置以e3p为参照基准；
27、4)在1)中酶的3’端引入任意长度优选6nt的碱基序列，优选为gtccga；
28、5)在1)中酶的3’端引入不超过6nt的截短，优选不超过3nt的截短，即底物识别区可以小于10nt；
29、6)上述2-5)的酶的5’端与底物连接形成顺式结构；
30、7)上述2-6)的任意组合。
31、在本专利技术的具体实施方式中，所述dnazyme为：
32、
33、其中：a突变b(b＝c/g/t)、g突变h(h＝a/t/c)、t突变v(v＝a/g/c)、c突变d(d＝g/a/t)。
34、本专利技术第四方面提供上述dnazyme切割底物反应的用途。
35、在本专利技术的具体实施方式中，所述切割在包含有机溶剂的溶液中进行，优选地，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐有机溶剂的切割RNA的DNAzyme筛选或设计文库，所述文库基于DNAzyme E3P(5’-AAGTGGTGCCCGGAAAGGGTGACTCA-底物识别区-3’)构建，包括：在E3P的3’和5’端分别引入若干个碱基，与E3P原有的一部分序列一起作为PCR引物识别区、在可变区域引入随机序列，其中E3P的可变区域是指E3P的5’端起第20-26个碱基；
2.耐有机溶剂的切割RNA的DNAzyme，所述DNAzyme包括如下结构：从5’到3’依次包含5’引物识别区，E3P的1-19位的茎环区，E3P的20-26位的可变区，以及位于E3P可变区任选存在的定向进化区(通过体外筛选从随机文库中获得的序列)，底物识别区，任选的3’引物识别区；
3.耐有机溶剂的RNA切割型DNAzyme，包括：
4.如权利要求3所述的酶，包括：
5.权利要求2-4任一项所述DNAzyme切割底物反应的用途；
6.靶序列核酸激活的多组分DNAzyme(MNAzyme)，所述多组分DNAzyme包含如下部分：
7.权利要求6所述多
8.一种信号放大器，包含权利要求2-4任一项所述的酶和偶联的生物识别元件例如抗体和适体；
9.一种试剂盒，包含权利要求2-4任一项所述的酶，或权利要求6所述的多组分DNAzyme，或权利要求8所述的信号放大器。
...【技术特征摘要】
1.一种耐有机溶剂的切割rna的dnazyme筛选或设计文库，所述文库基于dnazyme e3p(5’-aagtggtgcccggaaagggtgactca-底物识别区-3’)构建，包括：在e3p的3’和5’端分别引入若干个碱基，与e3p原有的一部分序列一起作为pcr引物识别区、在可变区域引入随机序列，其中e3p的可变区域是指e3p的5’端起第20-26个碱基；
2.耐有机溶剂的切割rna的dnazyme，所述dnazyme包括如下结构：从5’到3’依次包含5’引物识别区，e3p的1-19位的茎环区，e3p的20-26位的可变区，以及位于e3p可变区任选存在的定向进化区(通过体外筛选从随机文库中获得的序列)，底物识别区，任选的3’引物识别...
【专利技术属性】
技术研发人员：邴涛，常天俊，李光平，曹倩倩，李素慧，段巧，梁英，张帅奇，孟辉，谭蔚泓，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：
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