【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过使用从特定细胞微隔室获得的肝脏微组织治疗肝衰竭。本专利技术尤其涉及特定肝脏微组织、其制备方法及其用途。
技术介绍
0、现有技术
1、肝脏是人体最复杂的器官之一。作为消化系统不可或缺的一部分，不断地向肝脏供给由消化产生的营养物质或有毒物质。肝脏对这些物质的加工是生物体所必需的并且具有以下目的：
2、-储存和分配来自消化的营养物
3、-降解有毒物质
4、-合成大多数血蛋白，以及
5、-产生胆汁。
6、为了执行这些功能，肝脏由多种细胞组成，诸如肝细胞、胆管细胞(胆管细胞)、星状细胞(ito细胞)、库普弗细胞(kupffer cell)、间充质干细胞和内皮细胞。
7、肝细胞是最具代表性的肝脏细胞，并且负责大部分肝功能，从脂肪酸合成到尿素生产到血浆蛋白合成。
8、胆管细胞是形成胆管壁的极化上皮细胞。它们在调节胆汁分泌和收集胆汁以将其从肝细胞转运至肠道方面具有作用。
9、其他细胞提供良好的血管形成以及信号传导功能并提供与其他肝脏细胞和与免疫系统细胞的相互作用。
10、当肝脏不能再执行其功能时，将其称为肝衰竭。肝衰竭的主要原因是病毒感染、药物过量、免疫性病症、遗传性疾病或血液循环病症。当肝功能的损伤不可逆时，推荐的治疗是肝脏移植。
11、因此，肝脏移植代表对患有晚期肝脏疾病的人的标准治疗。
12、如今，在发现可以供给足够质量的肝脏用于移植的器官供体方面存在很大困难。
13
14、如今，只有2/3的患者可以从移植获益，并且只有在他们的生活质量已经极大恶化时受益。另外，在美国肝脏移植的预期费用为约1百万欧元(或1百万美元)。
15、面对这些问题，已经出现若干创新解决方案。
16、移植分离的肝细胞已经作为一种有吸引力的方法出现，但是临床试验仍然很少并且不确定，受到体内移植后分离的肝细胞的不良存活、整合和扩增的限制，因此这些因素限制了短期和长期治疗效果。事实上，从供体分离的肝细胞具有非常有限的体内和体外增殖能力。此外，进行培养的分离的肝细胞倾向于进入去分化过程，从而减少了获得足够数量的成熟肝细胞的机会。
17、尽管该技术使得可以治疗大量的患者，但施用的剂量常常不够，并且在注射细胞期间呈现出逃逸到体循环中的风险。
18、这主要是由于单个细胞难以整合到肝脏内，以及由原代细胞的制备及其体外培养诱导的质量差，且尽管有免疫抑制但排斥部分肝细胞。
19、因此，肝细胞供体的低数目、这些肝细胞的稳定性和有限的功能性构成它们使用的障碍。
20、然而，用于多能干细胞(即胚胎干细胞和诱导多能干细胞)的指导分化的方案的开发已经使得可以获得几乎取之不尽的肝细胞来源。
21、尽管有希望，但是源自多能细胞的肝细胞非常难以大规模培育并且产生不成比例的生产成本。例如，从诱导多能干细胞产生自体肝移植物的预期成本是大约970万美元。
22、迄今为止，指导分化方案不能产生多种功能细胞表型，尤其是足够的成熟肝细胞；获得的细胞保留胎儿肝细胞的特征，尤其是具有甲胎蛋白的持续表达和低白蛋白产量。
23、然而，某些方案使得可以获得具有更好功能特性的肝脏细胞。这些方案仍然复杂并且需要解离、再聚集或与尤其是间充质干细胞和内皮细胞共培养的步骤。这些附加步骤增加附加风险，增加了总成本并且降低了成品的控制。
24、对于在细胞疗法中的应用，必须能够适应现有方法以便：i)为了在大规模上有效，用有限数目的步骤获得产生，ii)改善移植细胞的整合。如今开发的技术不能产生从诱导多能干细胞获得的适于大规模培养且呈递功能性肝细胞的肝脏微组织。
25、目前用于产生肝脏微组织的方法仍然太复杂，具有多个步骤，因此成本非常高，并且难以扩大规模。
26、因此强烈需要能够大规模产生包含多种肝细胞表型的肝脏微组织的溶液，
27、肝脏微组织可以大规模生产并直接移植，以满足肝脏移植的重要需求。
28、因此，本专利技术的目标是满足所有这些需要并克服现有技术的缺点和限制。
技术实现思路
1、为了实现该目的，本专利技术提出了一种特定肝脏微组织，该特定肝脏微组织适于在细胞疗法且尤其是在对抗肝衰竭中使用。
2、为此，本专利技术的主题是一种三维肝脏微组织，该三维肝脏微组织的最大尺寸在500μm至700μm之间，以每百万细胞至少75,000rlu的活性表达cyp3a4单加氧酶并且每24小时每百万细胞产生至少18μg尿素。
3、有利地，与尿素产生相关的cyp3a4的活性使得可以保证肝脏微组织至少包含功能性肝脏细胞。
4、优选地，这些肝脏细胞每24小时每百万细胞分泌至少75μg白蛋白。
5、因此，肝脏微组织表现出类似于健康肝脏的代谢活性。
6、根据另一个目的，本专利技术涉及一种肝脏微组织，该肝脏微组织包含肝脏细胞的至少3种不同表型，该微组织的所述细胞已经全部从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞获得。
7、有利地，该肝脏微组织具有足够的细胞多样性以持续地恢复和/或改善肝脏功能。
8、优选地，该肝脏微组织至少包含未成熟肝细胞、成熟肝细胞和胆管细胞。
9、根据本专利技术的优选目的，该肝脏微组织至少包含：
10、-肝脏细胞，其中至少40％的肝脏细胞表达细胞角蛋白19(ck19)，和
11、-表达cd73和cd90的细胞。
12、优选地，表达cd73和cd90的细胞是间充质干细胞，并且表达ck19的细胞是胆管细胞。
13、有利地，该肝脏微组织的表型组成接近于健康人肝脏的表型组成。
14、优选地，根据本专利技术的肝脏微组织包含：
15、-至少一个内腔，
16、-与内腔和该微组织外部的介质接触的该微组织的至少一个细胞，和
17、-至少一个仅被细胞包围的细胞。
18、有利地，该肝脏微组织的构造接近于发育中的肝脏组织的构造，这使得肝脏微组织尤其能够促进其整合到肝脏中及在所治肝脏中代谢功能的适当表现。根据特别优选的实施方案，该肝脏微组织为卵形、圆柱形、球状体或球形或基本上卵形、圆柱形、球状体或球形或椭圆形形状。优选地，该肝脏微组织为椭圆形形状。
19、有利地，该微组织的椭圆形形状使得可以促进该肝脏微组织的存活。因此，大部分肝脏微组织被所治肝脏整合。
20、优选地，根据本专利技术的肝脏微组织包含至少一个胆管和/或至少一种糖原颗粒。
21、根据本专利技术的优选目的，该肝脏微组织包含：
22、-50％至99％的肝脏细胞，包括20％至60％的表达ck19的细胞，和
23、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三维肝脏微组织，所述三维肝脏微组织的最大尺寸在500μm至700μm之间，以每百万细胞至少75,000RLU的活性表达CYP3A4单加氧酶并且每24小时每百万细胞产生至少18μg尿素。
2.根据前一权利要求所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含50％至99％的肝脏细胞。
3.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从诱导多能干细胞获得的。
4.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞获得的。
5.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏细胞每24小时每百万细胞分泌至少75μg白蛋白。
6.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从诱导多能干细胞获得的并且所述肝脏细胞在分化开始后至少20天每24小时每百万细胞分泌至少75μg白蛋白。
7.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，所述肝脏微组织包含肝脏细胞的至少3种不同表型，其特征在于所述微组织的所有
8.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含未成熟肝细胞、成熟肝细胞和胆管细胞。
9.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织至少包含：
10.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含表达CD73和CD90的细胞。
11.根据前一权利要求所述的肝脏微组织，其特征在于表达CD73和CD90的所述细胞是间充质干细胞。
12.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织至少包含肝脏细胞，其中所述肝脏细胞中的20％至60％的细胞是表达细胞角蛋白19的细胞。
13.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述微组织的所有细胞已经全部从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞的至少一个胞囊的分化获得。
14.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，所述肝脏微组织包含：
15.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有椭圆形形状。
16.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏细胞是极化的。
17.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含50％至99％的肝脏细胞，其中20％至60％的所述肝脏细胞是表达细胞角蛋白19的细胞，并且1％至20％的所述肝脏细胞是表达CD73和CD90的细胞。
18.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有在100μm至300μm之间的直径或最小尺寸。
19.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有在500μm至700μm之间的最大尺寸。
20.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含300至14,000个细胞。
21.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含至少一个胆管。
22.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含至少一种糖原颗粒。
23.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏细胞选自成熟肝细胞、未成熟肝细胞、成肝细胞、胆管细胞以及它们的混合物。
24.一种三维封闭微隔室，所述三维封闭微隔室包含限定内部部分的外部水凝胶层，所述内部部分包含至少一个根据权利要求1至23中的一项所述的肝脏微组织。
25.根据权利要求24所述的细胞微隔室，其特征在于所述微隔室是在由所述外部水凝胶层限定的所述内部部分中封装1至200个诱导多能干细胞后20天获得的。
26.根据权利要求24或25中的一项所述的细胞微隔室，其特征在于所述细胞微隔室在分化开始后20天表现出至少15倍的扩增速率。
27.根据权利要求24至26中的一项所述的细胞微隔室，其特征在于所述外部层的厚度是可变的并且在20μm至60μm之间。
28.根据权利要求24至27中的一项所述的细胞微隔室，其特征在于所述外部层包含藻酸盐。
29.根据权利要求24至28中的一项所述的细胞微隔室，其特征在于所述细胞微隔室在介于所述外部层和所述肝脏微组织之间的所述内部部分中包含细胞外基质成分或者天然或合成的细胞外基质。<...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种三维肝脏微组织，所述三维肝脏微组织的最大尺寸在500μm至700μm之间，以每百万细胞至少75,000rlu的活性表达cyp3a4单加氧酶并且每24小时每百万细胞产生至少18μg尿素。
2.根据前一权利要求所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含50％至99％的肝脏细胞。
3.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从诱导多能干细胞获得的。
4.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞获得的。
5.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏细胞每24小时每百万细胞分泌至少75μg白蛋白。
6.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织是从诱导多能干细胞获得的并且所述肝脏细胞在分化开始后至少20天每24小时每百万细胞分泌至少75μg白蛋白。
7.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，所述肝脏微组织包含肝脏细胞的至少3种不同表型，其特征在于所述微组织的所有细胞已经全部从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞获得。
8.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含未成熟肝细胞、成熟肝细胞和胆管细胞。
9.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织至少包含：
10.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含表达cd73和cd90的细胞。
11.根据前一权利要求所述的肝脏微组织，其特征在于表达cd73和cd90的所述细胞是间充质干细胞。
12.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织至少包含肝脏细胞，其中所述肝脏细胞中的20％至60％的细胞是表达细胞角蛋白19的细胞。
13.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述微组织的所有细胞已经全部从封装在单个三维封闭微隔室中的诱导多能干细胞的至少一个胞囊的分化获得。
14.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，所述肝脏微组织包含：
15.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有椭圆形形状。
16.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏细胞是极化的。
17.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含50％至99％的肝脏细胞，其中20％至60％的所述肝脏细胞是表达细胞角蛋白19的细胞，并且1％至20％的所述肝脏细胞是表达cd73和cd90的细胞。
18.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有在100μm至300μm之间的直径或最小尺寸。
19.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织具有在500μm至700μm之间的最大尺寸。
20.根据前述权利要求中的一项所述的肝脏微组织，其特征在于所述肝脏微组织包含300至14,000个细胞。...
【专利技术属性】
技术研发人员：马克西姆·费约，迪利亚娜·托多罗娃，埃莉斯·沃特，
申请(专利权)人：树蛙疗法公司，
类型：发明
国别省市：
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