【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性的方法及slwrky5过表达载体和应用。
技术介绍
1、番茄(solanum lycopersicum l.)是我国重要的蔬菜作物之一，常年栽培面积超过100万hm2，鲜食番茄产量稳居世界第一。然而，番茄是一种对温度和病害敏感的作物，在我国番茄设施生产中，会经常遭遇高温危害，同时病害加剧，给番茄生产造成了严重的经济损失。
2、番茄幼苗在生长期间适宜的生长温度约为昼温24～26℃，夜温18℃左右。一般品种在昼温34℃，夜温20℃以上即受到损害，当温度上升到昼温38℃或夜温26℃以上，番茄就会受到严重损伤。开花坐果期高温则导致番茄花粉活力下降，柱头外露，坐果率降低，致使产量和品质严重下降。在温度升高时，首先植物蒸腾作用加剧，大量失水，植物体内水分生理失衡，造成叶片萎蔫，光合受阻，生长减缓。高温胁迫下，细胞会产生大量的活性氧(ros)，造成膜脂和蛋白质的过氧化，产生的丙二醛还会进一步加剧细胞膜的损伤，严重时甚至可以导致细胞死亡。
3、在高温高湿环境下番茄还极易发生灰霉病，这是一种以灰葡萄孢(botrytiscinereal)为病原菌的坏死性真菌，主要靠其分生孢子进行传播，是设施栽培中的常见病害，并且生产中难以防治。在环境适宜时，灰霉菌通过幼嫩、衰弱的组织或伤口侵入到寄主内，实现初步侵染，发病后可形成灰色霉层。随着病菌发展，叶片出现水渍状，边缘不规则，浅褐或黄褐色病斑；果实发病果皮变成灰白色，果肉呈水渍状、软腐，在病斑处长出带有绒毛的灰霉层。番茄因受灰
4、利用现代分子生物技术发掘番茄耐热及抗病基因资源，并在番茄中调控其表达，是培育抗逆抗病番茄新品种的重要手段。wrky转录因子参与植物多种生物过程，特别是在调节生物和非生物胁迫方面发挥重要作用。slwrky5转录因子是wrky转录因子家族中的一个成员，需要开发slwrky5转录因子在番茄栽培中提高高温耐性并提高灰霉病抗性的相关功能。
技术实现思路
1、为开发slwrky5转录因子在在番茄栽培中提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性中的应用，本专利技术提供了提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性的方法及slwrky5过表达载体和应用。本专利技术通过过表达slwrky5基因显著提高了番茄的耐热能力并增强了番茄对灰霉菌的抗性。
2、本专利技术提供了过表达slwrky5基因的制剂在番茄栽培中的应用，过表达slwrky5基因的制剂通过slwrky5基因的过表达提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
3、本专利技术通过调控slwrky5基因在番茄中过表达，使番茄的耐热能力增强并对灰霉菌的抗性提高。
4、进一步地，过表达slwrky5基因的制剂为slwrky5过表达载体，通过构建slwrky5过表达载体转化感受态细胞，然后侵染番茄植株从而提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
5、进一步地，所述侵染番茄植株过程为：将含有slwrky5过表达载体的农杆菌菌株浸染番茄子叶。
6、进一步地，所述过表达slwrky5基因的制剂以所述slwrky5过表达载体为唯一有效成份。
7、进一步地，slwrky5过表达载体构建过程为：将seq id no.1所示的slwrky5基因片段和线性化phellsgate8载体进行重组获得。
8、进一步地，扩增所述slwrky5基因片段的引物为seq id no.2所示的slwrky5-oe-fw引物和seq id no.3所示的slwrky5-oe-rv引物。
9、本专利技术还提供了一种slwrky5过表达载体的构建方法，步骤如下：
10、slwrky5基因片段的扩增：以番茄cdna为模板，以seq id no.2和seq id no.3所示基因片段为引物对，使用phanta酶，进行pcr扩增获得长度为1461bp的基因片段，即slwrky5基因片段；
11、pcr扩增反应体系为：1u/μl的phanta max super-fidelity dna polymerase1μl；2×phanta max buffer 25μl；10μm的上游引物2μl；10μm的下游引物2μl；dna 模板1μl；dntp mix 1μl；ddh2o up to 50μl；
12、将slwrky5基因片段和线性化phellsgate8载体进行重组获得slwrky5过表达载体；
13、slwrky5基因片段和线性化phellsgate8载体的重组体系为：线性化载体40ng，slwrky5基因片段回收产物6ng，exnaseii 1ul，2×ce ii buffer 2ul，ddh2o补充到10ul。
14、本专利技术还提供了所述构建方法得到的slwrky5过表达载体。
15、本专利技术还提供了一种提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性的方法，包括如下步骤：
16、slwrky5基因片段的扩增：以番茄cdna为模板，以seq id no.2和seq id no.3所示基因片段为引物对，使用phanta酶，进行pcr扩增获得长度为1461bp的基因片段，即slwrky5基因片段；
17、将slwrky5基因片段和线性化phellsgate8载体进行重组获得的slwrky5过表达载体；
18、slwrky5过表达载体热激转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并抽提重组质粒，转化农杆菌c58，获得含有slwrky5过表达载体的农杆菌菌株；
19、用含有slwrky5过表达载体的农杆菌菌株浸染番茄子叶，构建获得耐高温和抗灰霉病的番茄转基因植株。
20、进一步地，pcr扩增程序为：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
22、本专利技术通过调控slwrky5基因在番茄中过表达，使番茄的耐热能力和对灰霉菌的抗性提高。克隆番茄中的slwrky5转录因子，并在番茄中过表达，在高温胁迫下，slwrky5过表达植株与野生型番茄ailsa craig(ac)相比表现出明显的耐热性，相对电导率、丙二醛含量以及活性氧等胁迫相关指标均显著低于ac。用灰霉菌侵染slwrky5转基因植株，其slwrky5过表达植株表现出对灰霉菌更强的抗性。
23、本专利技术开发了slwrky5基因在番茄中的新用途，过表达slwrky5基因显著提高了番茄的耐热能力并增强了番茄对灰霉菌的抗性。
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1.过表达SlWRKY5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，过表达SlWRKY5基因的制剂通过SlWRKY5基因的过表达提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
2.根据权利要求1所述的过表达SlWRKY5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，过表达SlWRKY5基因的制剂为SlWRKY5过表达载体，通过构建SlWRKY5过表达载体转化感受态细胞，然后侵染番茄植株从而提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
3.根据权利要求2所述的过表达SlWRKY5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，所述侵染番茄植株过程为：将含有SlWRKY5过表达载体的农杆菌菌株浸染番茄子叶。
4.根据权利要求2所述的过表达SlWRKY5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，所述SlWRKY5过表达载体通过将SEQ ID NO.1所示的SlWRKY5基因片段和线性化pHellsgate8载体进行重组获得。
5.根据权利要求4所述的过表达SlWRKY5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，扩增所述SlWRKY5基因片段的引物为SE
6.一种SlWRKY5过表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：
7.一种权利要求6所述构建方法得到的SlWRKY5过表达载体。
8.一种提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的提高番茄耐高温能力和灰霉病抗性的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。
...【技术特征摘要】
1.过表达slwrky5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，过表达slwrky5基因的制剂通过slwrky5基因的过表达提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
2.根据权利要求1所述的过表达slwrky5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，过表达slwrky5基因的制剂为slwrky5过表达载体，通过构建slwrky5过表达载体转化感受态细胞，然后侵染番茄植株从而提高番茄的耐热能力并增强番茄对灰霉菌的抗性。
3.根据权利要求2所述的过表达slwrky5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，所述侵染番茄植株过程为：将含有slwrky5过表达载体的农杆菌菌株浸染番茄子叶。
4.根据权利要求2所述的过表达slwrky5基因的制剂在番茄栽培中的应用，其特征在于，所述slwrky5过表达载体通过将seq id no.1所示的sl...
【专利技术属性】
技术研发人员：李国斌，陈果，胡晓辉，李建明，贾敏，孙玚，王子怡，司倩琳，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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