【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测，具体为一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的引物探针组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、香蕉穿孔线虫(radopholus similis)又名香蕉烂根病，属小杆目(rhabditida)、垫刃亚目(tylenchina)、垫刃总科(tylenchoidea)、短体科(pratylenchidae)、穿孔属(radopholus)，是世界范围的检疫性有害生物，已知寄主多达300多种，严重危害香蕉(musaspp.)、柑橘(citrus spp.)和胡椒(piper nigrum)等经济作物以及天南星科(araeae)和竹芋科(marantaceae)等观赏植物，目前已报道有该线虫分布的国家和地区超过90个。近些年，进出口花卉日益频繁，香蕉穿孔线虫随寄主植物远距离传播，逐渐成为影响植物产品贸易的重要病原。因此建立香蕉穿孔线虫的准确、快速、灵敏的分子检测技术，显得越来越重要。
2、目前为有效防止香蕉穿孔线虫进境，通常采用的检疫、检测和鉴定方法包括形态学方法、同工酶方法和聚合酶链反应方法。形态学方法要求相关人员要有丰富的经验，并且由于香蕉穿孔线虫存在种内变异，这种方法的检疫、检测和鉴定结果往往准确率不高，所需要的时间与操作人员的经验相关联；同工酶方法只能对雌虫进行检疫、检测和鉴定，对幼虫和雄虫不能进行检疫、检测和鉴定，而且所需要的时间长达一天左右。基于pcr的聚合酶链反应分子诊断方法可以基本满足香蕉穿孔线虫的准确快速检疫、检测和鉴定要求。但普通pcr需要电泳或者测序，耗时较长；qpcr需要复杂的
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的引物探针组合，该引物探针组合能够快速、特异准确地鉴定待测样本中是否含有香蕉穿孔线虫。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的试剂盒。
3、本专利技术的另一目的在于提供一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的方法。
4、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
5、本专利技术提供了一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括引物对和rna荧光探针；所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述rna荧光探针的核苷酸序列如seq id no.19所示。
6、优选地，所述rna荧光探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。
7、本专利技术还提供了一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的试剂盒，包含所述的引物探针组合。
8、优选地，所述试剂盒还包括基础干粉、激活液和无核酶水。
9、本专利技术还提供了一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测方法，包括如下步骤：
10、(1)提取待测样本的dna；
11、(2)以提取的dna为模板，利用所述的引物探针组合，或所述试剂盒进行酶介导双重指数扩增核酸检测；
12、(3)根据检测到的荧光曲线的特征和荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在香蕉穿孔线虫。
13、优选地，所述判断的标准为：若待测样本检测出现扩增曲线且ct值≤20时，则判定样本中存在香蕉穿孔线虫；若待测样本没有扩增曲线或ct值>20，则判定样本中不存在香蕉穿孔线虫。
14、优选地，所述酶介导双重指数扩增核酸检测的反应程序为：40～45℃条件下，每隔0.5～2min检测一次荧光信号，循环次数为20～35个。
15、优选地，所述酶介导双重指数扩增核酸检测的反应体系包括如下组分：基础干粉、8μm～12μm的上游引物1μl、8μm～12μm下游引物1μl、8μm～12μm的rna荧光探针1μl、模板dna3μl、无核酶水4μl，8μm～12μm激活液10μl。
16、本专利技术还提供了一种所述的引物探针组或所述的试剂盒在检测香蕉穿孔线虫中的应用。
17、本专利技术还提供了一种所述的引物探针组或所述的试剂盒在制备用于检测香蕉穿孔线虫产品中的应用。
18、本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
19、emdea(enzymes-mediated duplex exponentialamplification)等温荧光快检方法是一种酶介导双重指数扩增快速核酸检测技术，通过多酶协作对靶标核酸及荧光探针进行双重放大，短时间内达到极高检测灵敏度与特异性。本专利技术以香蕉穿孔线虫(radopholussimilis)its序列为靶标进行引物设计，采用酶介导双重放大(emdea)核酸扩增检测技术，定性检测香蕉穿孔线虫，相较于传统的qpcr检测，该方案兼具快速、简单、便携等优势，检测时间控制在30min之内，灵敏度高，抗污染性强，能够极大降低扩增产物气溶胶形成并溢出导致污染的风险。本专利技术为快速精确地实现香蕉穿孔线虫的检测提供了可靠的技术支持。
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1.一种香蕉穿孔线虫EmDEA等温荧光检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括引物对和RNA荧光探针；所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述RNA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述RNA荧光探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。
3.一种香蕉穿孔线虫EmDEA等温荧光检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基础干粉、激活液和无核酶水。
5.一种香蕉穿孔线虫EmDEA等温荧光检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：若待测样本检测出现扩增曲线且Ct值≤20时，则判定样本中存在香蕉穿孔线虫；若待测样本没有扩增曲线或Ct值>20，则判定样本中不存在香蕉穿孔线虫。
7.
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶介导双重指数扩增核酸检测的反应体系包括如下组分：基础干粉、8μM～12μM的上游引物1μL、8μM～12μM下游引物1μL、8μM～12μM的RNA荧光探针1μL、模板DNA3μL、无核酶水4μL，8μM～12μM激活液10μL。
9.权利要求1～2任意一项所述的引物探针组或权利要求3～4任意一项所述的试剂盒在检测香蕉穿孔线虫中的应用。
10.权利要求1～2任意一项所述的引物探针组或权利要求3～4任意一项所述的试剂盒在制备用于检测香蕉穿孔线虫产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括引物对和rna荧光探针；所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述rna荧光探针的核苷酸序列如seq id no.19所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述rna荧光探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。
3.一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基础干粉、激活液和无核酶水。
5.一种香蕉穿孔线虫emdea等温荧光检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：若待测样本检测出现扩增曲线...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵立荣，徐春玲，武目涛，顾建锋，杨思华，潘泽堃，于焦，冯黎霞，赵菊鹏，李献锋，于璇，邵晨曦，吴尧，李秋实，
申请(专利权)人：广州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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