一种用于小鼠肾类器官的培养基及培养方法技术

技术编号：43956459 阅读：2 留言：0更新日期：2025-01-07 21:41

本发明专利技术涉及一种用于小鼠肾类器官的培养方法，其包括以下步骤：(1)从小鼠肾脏组织提取原代细胞，制备成体干细胞；(2)将成体干细胞分散在扩增培养基和基质胶的混合液中，孵育，直至混合液凝固；(3)加入扩增培养基培养7‑10天，传代后继续在扩增培养基中培养至少2‑4天；(4)将扩增培养基更换为分化培养基，继续培养11‑14天，得到小鼠肾类器官。本发明专利技术采用扩增培养基和分化培养基分两个阶段进行肾类器官培养，促进了肾脏多种细胞类型的全面分化，能够缩短小鼠肾类器官的培养周期，提高分化成功率。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及类器官培养领域，具体涉及一种用于小鼠肾类器官的培养基及培养方法。

技术介绍

1、类器官(organoids)是一种在体外3d培养条件下，利用成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞自组装诱导生成的具有三维空间结构的“迷你器官”，具有类似真实器官的复杂结构及多种细胞类型，并能最大限度模拟来源组织或器官的生理病理状态。

2、目前肾脏类器官大多数是由多能干细胞诱导分化而成，包括肾单位类器官和输尿管/集合管类器官。例如cn117070440a专利公开了一种高效构建人肾脏类器官的方法，该方法是基于hpscs诱导肾类器官，由多能胚胎干细胞(es)及其人工诱导多能干细胞(ipsc)诱导的类器官，这种方法存在费时费力，技术需求较高，分化方向存在一定的不可控性、基因组稳定性较差，无法进一步增殖等缺点；同时ipsc衍生的类器官类似于人类肾脏发育的早期阶段，含有非肾脏细胞类型，不是模拟成人疾病或研究潜在再生疗法的理想系统。cn105378062a专利公开了包含分离和培养src+肾细胞群来源类器官及其用途，该方法需要先通过流式或磁珠分选出src+肾细胞群，然后培养为类器官，制备过程较为繁琐，且缺少肾小球细胞。cn116218762a专利公开了一种肾小管类器官培养基及肾小管类器官的培养方法，该方法制备的是肾小管类器官，缺少肾小球细胞。

3、目前暂未见基于肾脏组织来源原代细胞制备包含多种肾脏组织细胞类型(包括近端肾小管、髓袢、远端肾小管和肾小球)的小鼠肾类器官培养方法。

技术实现思路</p>

1、为解决上述技术问题，本专利技术包括以下几个方面：

2、本专利技术的第一方面提供一种小鼠肾类器官的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

3、(1)从小鼠肾脏组织提取原代细胞，制备成体干细胞；

4、(2)将步骤(1)得到的成体干细胞分散在扩增培养基和基质胶的混合液中，孵育，直至混合液凝固；

5、(3)加入扩增培养基培养7-10天，传代后继续在扩增培养基中培养至少2-4天；

6、(4)将扩增培养基更换为分化培养基，继续培养11-14天，得到小鼠肾类器官；

7、所述小鼠肾类器官包含近端肾小管细胞、髓袢细胞、远端肾小管细胞和肾小球细胞。

8、优选的，所述小鼠肾脏组织为c57bl/6小鼠肾脏组织。

9、优选的，所述步骤(1)中制备成体干细胞的具体方法如下：

10、(i)收集组织：处死小鼠，解剖，将分离的肾脏放入基础培养基中；

11、(ii)修剪组织：去掉脂肪等其他组织；

12、(iii)消化组织：加入胶原酶iv，置于摇床中消化；

13、(iv)镜检：用移液器上下吹打10-20次促进组织破碎，镜检是否存在导管结构，如果没有则继续消化；

14、(v)终止消化：加入洗涤培养基重悬终止消化，70μm细胞筛网过滤，离心去上清，剩余沉淀物即为包含成体干细胞的原代细胞。

15、优选的，所述步骤(i)中的基础培养基包含advanced dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-链霉素混合液和y-27632。

16、更优选的，所述步骤(i)中的基础培养基包含advanceddmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-链霉素混合液和5-20μm y-27632。以上组分含量百分比均为体积百分比。

17、进一步优选的，所述步骤(i)中的基础培养基包含advanced dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-链霉素混合液和10μm y-27632。以上组分含量百分比均为体积百分比。

18、优选的，所述步骤(v)中加入的洗涤培养基为含1％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的高糖dmem培养基。以上组分含量百分比均为体积百分比。

19、优选的，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基包含advanced dmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素b、包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i、n-乙酰半胱氨酸、b27 supplement、a83-01、egf、fgf-10和y-27632。

20、更优选的，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基包含advanced dmem/f12、0.5-2％hepes、0.5-2％glutamax、0.5-2％青霉素-链霉素混合液、10-50μg/ml庆大霉素、20-100μg/ml两性霉素b、30-50％包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i、0.5-2mm n-乙酰半胱氨酸、0.5-3％b27 supplement、1-10μm a83-01、20-100ng/ml egf、50-200ng/ml fgf-10和5-20μm y-27632。以上组分含量百分比均为体积百分比。

21、进一步优选的，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基包含advanceddmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-链霉素混合液、20μg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i、1.25mm n-乙酰半胱氨酸、1.5％b27 supplement、5μm a83-01、50ng/ml egf、100ng/ml fgf-10和10μm y-27632。以上组分含量百分比均为体积百分比。

22、进一步优选的，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基由advanced dmem/f12、1％hepes、1％glutamax、1％青霉素-链霉素混合液、20μg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素b、40％包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i、1.25mm n-乙酰半胱氨酸、1.5％b27 supplement、5μm a83-01、50ng/ml egf、100ng/ml fgf-10和10μm y-27632组成。以上组分含量百分比均为体积百分比。

23、优选的，所述包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i的制备方法如下：

24、(a)将5*107个l-wrn细胞接种于15cm培养皿，添加25-30ml培养基；

25、(b)培养60～72h后收集第1批条件培养基，2000g/10min离心取上清，补充新鲜的培养基，上清于4℃保存；

26、(c)继续培养36～48h后收集第2批条件培养基，2000g/10min离心取上清，补充新的培养基；

27、(d)继续培养36～48h后收集第3批条件培养基，2000g/10min离心取上清，所有条件培养基合并混匀分装后保存于-80℃。

28、优选的，所述步骤(a)中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种小鼠肾类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基包含AdvancedDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX、青霉素-链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素B、包含Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin的条件培养基I、N-乙酰半胱氨酸、B27 supplement、A83-01、EGF、FGF-10和Y-27632。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述包含Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin的条件培养基I的制备方法如下：

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包含芳香维甲酸、醋酸氟氢可的松和佛司可林。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包含A83-01、包含Wnt-3A的条件培养基II、芳香维甲酸、醋酸氟氢可的松和佛司可林。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包

7.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于，所述包含Wnt-3A的条件培养基II的制备方法如下：

8.一种用于培养小鼠肾类器官的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物包含扩增培养基和分化培养基，所述扩增培养基包含Advanced DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX、青霉素-链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素B、包含Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin的条件培养基I、N-乙酰半胱氨酸、B27 supplement、A83-01、EGF、FGF-10和Y-27632，所述分化培养基包括Advanced DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX、青霉素-链霉素混合液、包含Wnt-3A的条件培养基II、A83-01、芳香维甲酸、醋酸氟氢可的松和佛司可林。

9.权利要求8所述的培养基组合物在培养小鼠肾类器官方面的应用，其特征在于，所述小鼠肾类器官包含近端肾小管细胞、髓袢细胞、远端肾小管细胞和肾小球细胞。

10.权利要求8中所述的分化培养基在促进小鼠肾类器官细胞分化方面的应用，其特征在于，所述小鼠肾类器官细胞同时分化为近端肾小管细胞、髓袢细胞、远端肾小管细胞和肾小球细胞中的一种或多种。

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【技术特征摘要】

1.一种小鼠肾类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的扩增培养基包含advanceddmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-链霉素混合液、庆大霉素、两性霉素b、包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i、n-乙酰半胱氨酸、b27 supplement、a83-01、egf、fgf-10和y-27632。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述包含wnt-3a、r-spondin 3和noggin的条件培养基i的制备方法如下：

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包含芳香维甲酸、醋酸氟氢可的松和佛司可林。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包含a83-01、包含wnt-3a的条件培养基ii、芳香维甲酸、醋酸氟氢可的松和佛司可林。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分化培养基包含advanceddmem/f12、hepes、glutamax、青霉素-链霉素混合液、包含wnt-3a的条件培养基ii、a83-...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昕，丁仁博，郑成龙，蔡旭东，
申请(专利权)人：宁波市中医院，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人