【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及mmpe基因在调控牛分枝杆菌毒力中的应用，本专利技术还涉及一种牛分枝杆菌弱毒株及其制备方法。
技术介绍
1、结核病一直是全球公共卫生领域的重大挑战。结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)及其所属的结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosiscomplex,mtbc)是导致人类和动物结核病的主要病原菌，其中mtb是引发人类肺结核的主要致病菌，而mtbc中的牛分支杆菌和山羊分枝杆菌被称为mtb的牛变种和山羊变种，主要导致牛结核病和山羊结核病。牛分枝杆菌弱毒力株卡介苗(bcg)是目前市场上唯一许可用于预防人类结核病的疫苗，但其保护效果有限，无法完全阻止儿童肺结核病的发生和传播，对成年人无保护效果。因此，深入研究mtb的致病机制和免疫逃逸策略对于开发新的预防和治疗方案,遏制这一严重的人畜共患病至关重要。
2、mtb作为一种典型的胞内病原菌，在感染过程中会面临宿主细胞众多的防御策略，如巨噬细胞介导的抗原呈递、溶酶体成熟以及细胞凋亡等免疫反应。同时，mtb在与宿主长期对抗中也成功进化出一套复杂且精密的胞内生存机制。其中，通过分泌多种毒力因子来对抗和削弱宿主免疫反应的策略得到广泛关注，例如，mtb既能通过分泌ag85b、esat-6和cfp10等抗原抑制t细胞介导的特异性免疫反应，也能通过分泌磷酸酶sapm、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶pkng和核苷二磷酸激酶a(ndka)等毒力因子抑制巨噬细胞的先天性免疫反应，增强细菌的存活能力。目前，对
3、本专利技术以牛分枝杆菌为研究对象，首先利用生物信息学分析技术联合高内涵细胞成像系统，筛选出分枝杆菌中保守的核调节蛋白，随后以菌株bcg(atcc：35734)为研究对象，鉴定核调节蛋白对牛分枝杆菌感染宿主过程中毒力的影响。在此过程中我们发现(1)假想蛋白mmpe具有入核功能的同时能显著增强细菌毒力；(2)毒力因子mmpe依赖rrr20-22(r1)和rrk460-462(r2)氨基酸序列进入宿主细胞核；(3)mmpe进入宿主细胞核后能显著抑制宿主体内的炎症水平，增强牛分枝杆菌在宿主细胞内的存活和定植。因此mmpe及其突变体rrr20-22(δr1)和rrk460-462(δr2)有望作为新的靶点开发新型抗结核疫苗或药物，在动物和人结核病防治方面发挥作用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供mmpe基因在调控牛分枝杆菌毒力中的应用，同时还提供一种牛分枝杆菌弱毒株及其制备方法。本专利技术利用基因工程技术对牛分枝杆菌进行重组，获得的弱毒株具有免疫原性好，生产安全性高等优点。
2、为实现上述目的，申请人通过生物信息学分析并结合高内涵细胞成像系统对分枝杆菌的保守核调节蛋白进行鉴定，筛选出多个能进入宿主细胞核且含有核定位信号序列(nls)的目的蛋白。其中一种蛋白由mmpe基因所编码，所述mmpe基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，该蛋白含有两个nls，分别为rrr20-22(r1)和rrk460-462(r2)。
3、接着，从bcg基因组中扩增mmpe基因并构建重组质粒，用该重组质粒转染hek293t细胞，通过qrt-pcr和western blot实验检测了mmpe蛋白的入核能力，证实了mmpe基因所编码的蛋白是一种核调节蛋白。
4、进一步地，申请人使用同源重组技术，将外源性hyg抗性基因导入牛分枝杆菌基因组，通过同源序列交换，使外源性hyg基因的dna片段取代原位点上的mmpe基因，成功构建了mmpe基因被替换的重组bcg hyg::mmpe。同时，采用重叠延伸pcr对mmpe基因序列进行点突变，获得mmpe基因的两个nls分别或同时被修饰的截短突变片段mmpe-δr1、mmpe-δr2、mmpe-δr1r2，将所述截短突变片段分别与线性化回补质粒pljr965载体融合连接，获得mmpe基因回补质粒并转化已成功构建的mmpe基因敲除菌株bcg hyg::mmpe，最终成功构建了所述两个nls分别或同时被修饰的mmpe基因部分回补菌株comp-mmpe-δr1(rrr20-22缺失)、comp-mmpe-δr2(rrk460-462缺失)、comp-mmpe-δr1r2(rrr20-22和rrk460-462双缺失)。
5、将敲除菌株和各回补菌株分别感染巨噬细胞，检测牛分枝杆菌在宿主细胞内的存活能力。结果表明，与野生型菌株相比，敲除菌株bcg hyg::mmpe和回补菌株comp-mmpe-δr1、comp-mmpe-δr2、comp-mmpe-δr1r2在巨噬细胞中的存活能力明显减弱；与敲除菌株bcg hyg::mmpe相比，回补菌株comp-mmpe-δr1、comp-mmpe-δr2、comp-mmpe-δr1r2在巨噬细胞中的存活能力明显增强，该结果证明了mmpe基因能促进病原菌在宿主内的存活和定植，从而增强病原菌的毒力，而敲除mmpe基因能减少病原菌在宿主内的存活和定植从而降低毒力，且在此过程中，核定位信号序列rrr20-22(r1)和rrk460-462(r2)发挥了重要的作用。
6、另外，将野生型菌株bcg/pljr965、mmpe基因敲除菌株kommpe、mmpe基因完整回补菌株comp-mmpe、r1和r2双缺失mmpe基因部分回补菌株comp-mmpe-δr1r2分别感染小鼠，检测了肺部组织的细菌存活量和脾部的炎症因子水平。细菌存活数结果显示：与野生型菌株bcg/pljr965相比，敲除菌株kommpe以及基因部分回补菌株comp-mmpe-δr1r2在小鼠体内的存活能力显著降低；与敲除菌株kommpe相比，回补菌株comp-mmpe和comp-mmpe-δr1r2在小鼠肺部的存活能力明显增强，且完整回补菌株comp-mmpe更为显著；与完整回补菌株comp-mmpe相比，部分回补菌株comp-mmpe-δr1r2在小鼠肺部的存活能力显著下降。炎症水平检测结果显示：在先天性免疫阶段，相较于野生型菌株bcg/pljr965以及完整回补菌株comp-mmpe，敲除菌株kommpe和部分回补菌株comp-mmpe-δr1r2能显著诱导小鼠脾部炎症因子(il1α,il1β)的产生，表明mmpe基因能显著抑制机体受抗原刺激后产生的非特异性免疫应答，而敲除mmpe基因或对nls进行修饰，则可以提高机体对抗原的固有免疫。
7、综上，mmpe基因所编码的蛋白是一种核调节蛋白，定位于宿主细胞核中，进入细胞核后抑制宿主产生的炎症水平并增强病原菌在宿主细胞内的存活和定植，因此mmp本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.MmpE基因在调控牛分枝杆菌毒力中的应用，所述MmpE基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，MmpE基因所编码的蛋白是一种核调节蛋白，定位于宿主细胞核中，入核后行使抑制宿主炎症水平、增强牛分枝杆菌在宿主细胞内存活和定植的功能，且MmpE基因依赖于两个NLS发挥核定位功能，这两个NLS分别位于SEQID NO.2所示氨基酸序列的第20-22位和第460-462位。
2.一种牛分枝杆菌弱毒株，该弱毒株的MmpE基因被修饰导致功能缺失，或者MmpE基因的两个NLS分别或同时被修饰导致核定位功能缺失，所述MmpE基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述两个NLS分别位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第20-22位和第460-462位。
3.一种降低牛分枝杆菌毒力的方法，其特征在于：使用基因编辑技术对牛分枝杆菌基因组中的MmpE基因进行修饰，使MmpE基因功能缺失，或者使用基因编辑技术对MmpE基因的两个NLS分别或同时进行修饰，使NLS的核
4.如权利要求3所述的降低牛分枝杆菌毒力的方法，其特征在于：使用同源重组技术，将外源性目的基因导入牛分枝杆菌基因组，通过同源序列交换，使外源性目的基因的DNA片段取代原位点上的MmpE基因，得到MmpE基因被替换的牛分枝杆菌弱毒力菌株，或者将两个NLS分别或同时被修饰的MmpE基因DNA片段与回补质粒酶切连接，然后电转到上述MmpE基因被替换的牛分枝杆菌弱毒力菌株中，得到两个NLS分别或同时被修饰的MmpE基因回补弱毒力菌株。
5.如权利要求4所述的降低牛分枝杆菌毒力的方法，其特征在于：所述外源性目的基因是hyg抗性基因。
6.如权利要求4所述的降低牛分枝杆菌毒力的方法，其特征在于：所述回补质粒是pLJR965质粒。
7.权利要求2所述的弱毒株在制备牛分枝杆菌疫苗或药物中的应用。
8.一种牛分枝杆菌疫苗，含有权利要求2所述的弱毒株。
...【技术特征摘要】
1.mmpe基因在调控牛分枝杆菌毒力中的应用，所述mmpe基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，mmpe基因所编码的蛋白是一种核调节蛋白，定位于宿主细胞核中，入核后行使抑制宿主炎症水平、增强牛分枝杆菌在宿主细胞内存活和定植的功能，且mmpe基因依赖于两个nls发挥核定位功能，这两个nls分别位于seqid no.2所示氨基酸序列的第20-22位和第460-462位。
2.一种牛分枝杆菌弱毒株，该弱毒株的mmpe基因被修饰导致功能缺失，或者mmpe基因的两个nls分别或同时被修饰导致核定位功能缺失，所述mmpe基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述两个nls分别位于seq id no.2所示氨基酸序列的第20-22位和第460-462位。
3.一种降低牛分枝杆菌毒力的方法，其特征在于：使用基因编辑技术对牛分枝杆菌基因组中的mmpe基因进行修饰，使mmpe基因功能缺失，或者使用基因编辑技术对mmpe基因的两个nls分别或同时进行修饰，使nls的核定位功能缺失...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，陈柳，张磊，陈颖钰，刘晗，段宝洁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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