【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种活力提升的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体及其应用。
技术介绍
1、丹参素是一种天然存在的儿茶酚类化合物，可由对羟基苯乳酸邻位羟基化产生，具有抗血栓、降血脂和抗动脉粥样硬化等生理功能，在食品和医药领域具有重要应用价值。
2、在自然界中，丹参素主要存在于中草药丹参中，但天然来源中丹参素的含量相对较低，从植物中提取相对困难。
3、利用应用化学法合成丹参素存在合成步骤多，反应条件苛刻，环境污染等问题。利用生物转化法通过生物催化剂对具有苯酚结构的物质进行邻位羟基化来制备丹参素等儿茶酚结构化合物，具有反应条件温和、高选择性和环境友好等优点，因而备受关注和青睐。
4、目前，4-羟基苯乙酸酯3-羟化酶(4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，4hpa3h)由于其易于表达、催化效率高等优点，成为了丹参素制备的首选用酶。4hpa3h是细菌降解4-羟基苯乙酸(4hpa)的关键酶，它不仅可以对4hpa进行邻位羟基化，而且对众多苯酚类物质也具有良好的催化活性，展现了较广的底物谱([1]deng y，faivre b，back o，etal.structural and functional characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase from escherichia coli[j].chembiochem，2020，21(1-2)：163-170.[2]y.lin，y.yan.bio
5、尽管4hpa3h能够催化对羟基苯乳酸生成丹参素，但与其天然底物4hpa相比，其对丹参素的催化效率明显降低，严重制约了其对对羟基苯乳酸等非天然底物中的应用。
技术实现思路
1、基于现有技术中的不足，本专利技术提供了两种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体及其应用，本专利技术得到两种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶的突变体，这两种酶具有高于野生型4-羟基苯乙酸-3-羟化酶的酶活力，能高效催化合成丹参素。
2、一种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体，其特征在于，是由来自大肠杆菌(escherichia coli)的野生型4hpa3h酶进行突变获得，所述野生型4hpa3h酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体突变为以下任意一种：
3、(1)m205f；
4、(2)t398s。
5、其中，m205f表示：第205位氨基酸由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；t398s表示：第398位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸。
6、本专利技术还提供了编码所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因。其中突变位点为m205f的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因序列如seq id no.3所示；突变位点为t398s的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因序列分别如seq id no.4所示。
7、本专利技术还提供了包含所述基因的重组质粒。
8、本专利技术还提供了包含所述基因的基因工程细胞。具体的，可以是将大肠杆菌中野生型4hpa3h酶的编码基因突变为所述的基因，
9、或者向大肠杆菌中外源导入所述的基因。
10、本专利技术还提供了所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体、所述基因、或者所述基因工程细胞在催化对羟基苯乳酸生成丹参素中的应用。相较于野生型酶，突变体酶具有更好的催化活性，更适合工业应用。
11、本专利技术还提供了一种催化对羟基苯乳酸生成丹参素的方法，包括以下步骤：以对羟基苯乳酸为底物，添加所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体或者是所述基因工程细胞进行催化反应生成丹参素。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
13、本专利技术4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体由大肠杆菌(escherichia coli)来源的野生型4hpa3h酶经过突变所得，其中m205f、t398s两种突变体全细胞催化丹参素活性相对于wt提高了1.70和1.24倍。
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1.一种活力提升的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体，其特征在于，是由来自大肠杆菌(Escherichia coli)的野生型4HPA3H酶进行突变获得，所述野生型4HPA3H酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体突变为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，突变位点为M205F或T398S的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因序列分别如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
4.包含权利要求2所述基因的重组质粒。
5.包含权利要求2所述基因的基因工程细胞。
6.如权利要求5所述的基因工程细胞，其特征在于，将大肠杆菌中野生型4HPA3H酶的编码基因突变为权利要求2所述的基因，
7.权利要求1所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体、权利要求2或3所述基因、或者权利要求5或6所述基因工程细胞在催化对羟基苯乳酸生成丹参素中的应用。
8.一种催化对羟基苯乳酸生成丹参素的方法，其特征在于，包括以下步骤：以对
...【技术特征摘要】
1.一种活力提升的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体，其特征在于，是由来自大肠杆菌(escherichia coli)的野生型4hpa3h酶进行突变获得，所述野生型4hpa3h酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体突变为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，突变位点为m205f或t398s的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因序列分别如seq id no.3或seq id no.4所示。
4.包含权利要求2所述基因的重组质粒。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟睿，杨开，胡升，梅乐和，黄俊，吕常江，
申请(专利权)人：浙大宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：
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