【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然纳米药物，具体涉及一种真菌来源类外泌体纳米囊泡的提取方法和应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡被国际细胞外囊泡学会定义为“从细胞中自然释放出来的、被脂质双分子层包裹的、不能复制的颗粒，即不包含功能核”。细胞外囊泡可由各种类型的细胞释放，包括植物、动物和微生物的细胞。大量证据表明细胞外囊泡在许多生物过程中发挥重要作用，包括毒性处理、细胞间通讯和病原体防御。然而，细胞外囊泡的生物异质性阻碍了其临床应用，这种异质性既受细胞内生物过程的影响，也受人为操作的干扰。
2、在各种类型的囊泡中，植物来源的细胞囊泡被认为是风险较小的，因为它们大多数从食用和药用植物中提取。由于其形状与哺乳细胞来源的外泌体一致，因此被称为类外泌体。令人兴奋的是，植物细胞分泌的外泌体样纳米囊泡因其低毒性、低免疫风险、生物相容性、生态友好、低成本和易于批量生产等优点，正在成为下一代纳米治疗药物。植物来源的类外泌体纳米囊泡最早在20世纪60年代通过透射电子显微镜记录。尽管早期的观察未能证明其重要性，2013年zhang团队通过一种可扩展的方法成功从葡萄柚中提取了囊泡，并进行了生物学应用研究，由于其稳定性高，应用前景广阔，围绕植物来源的类外泌体纳米囊泡的研究引起了广泛关注。植物来源的类外泌体纳米囊泡的生物学组成主要分为蛋白质、脂质、核酸和次级代谢产物，不同来源的植物得到的类外泌体纳米囊泡在组成上存在差距，并具备不同的生物学效应和器官靶向性。
3、目前的研究多采用裸子植物和被子植物，但这些植物种植时间长，会受季节和产地的影响，导致植物类外
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种真菌来源类外泌体纳米囊泡的提取方法和应用。
2、真菌门中的可食用菌类，比如木耳、香菇、金针菇等，产地广泛、生长周期短，并且人工栽培技术成熟，质量可控性高；可食用真菌类外泌体的生物活性成分及含量稳定，支持大批量提取。本专利技术的类外泌体纳米囊泡提取方法普遍适用于可食用真菌，提供了真菌来源的类外泌体纳米囊泡的提取方法，并扩展了其生物医学应用。
3、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
4、一种真菌来源类外泌体纳米囊泡的提取方法，包括以下步骤：
5、(1)将真菌撕碎后加入溶液浸泡，然后加热煮沸，得到真菌菌液；
6、(2)将步骤(1)中60-100℃的真菌菌液榨汁，纱布过滤，获得真菌溶液；
7、(3)将步骤(2)中30-80℃的真菌溶液用70μm±10μm滤网过滤，500-1000g离心5-20分钟，收集上清液；
8、(4)将步骤(3)中20-60℃的上清液以10000-25000g离心15-80分钟，收集上清液；
9、(5)将步骤(4)得到的上清液先用孔径为0.45μm±0.1μm的滤膜过滤，再用孔径为0.22μm±0.05μm的滤膜过滤，收集滤液；
10、(6)将步骤(5)得到的滤液在0-40℃下进行第一次超滤，取滤液后进行第二次超滤，得到浓缩液即为真菌来源类外泌体纳米囊泡；第一次超滤使用截留孔径大小为90-100kda的超滤膜，第二次超滤使用截留孔径大小为10-30kda的超滤膜。
11、本专利技术选择新鲜可食用真菌，通过热水法制备真菌菌液，通过温度控制、过滤、离心及超滤法截留类外泌体纳米囊泡。
12、优选地，步骤(1)中，所述浸泡的时间为6-24h；所述浸泡的温度为0-40℃；所述溶液的ph范围为5.8～7.8；所述溶液选自水(去离子水)、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、tris-hcl缓冲液、tbs缓冲液、tbst缓冲液、te缓冲液和good's缓冲液中的至少一种。
13、进一步优选地，步骤(1)中，所述浸泡的时间为8-12h；所述浸泡的温度为4-10℃；所述溶液的ph范围为7.0～7.6。
14、优选地，步骤(1)中，所述真菌和溶液的质量体积比为100-200g：500ml。
15、优选地，步骤(1)中，所述真菌为可食用真菌。所述真菌选取整株菌类，包括菌盖和菌柄。
16、优选地，步骤(1)中，所述真菌选自香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头菇、竹荪、松口蘑(松茸)、白蘑、红菇、灵芝、雷丸、大红菇、松露、白灵菇、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌、块菌、干巴菌、冬虫夏草、白参菌、鸡枞菌、虎奶菇、紫丁香蘑、鸡油菌、松乳菇、奥德蘑(水鸡纵)、绣球菌、青头菌、珊瑚菌、黄柄鸡油菌(喇叭菌)、梭柄乳头菇(老人头)、双孢蘑菇、长根菇、马勃、茯苓、猪苓、毛头鬼伞、金耳、云芝、树舌、拟小牛肝菌、紫芝、金针菇、杏鲍菇、平菇、松蘑、榛蘑、竹黄、蜜环菌、桑黄的中的至少一种。
17、优选地，步骤(1)中，所述煮沸的时间为5-80分钟。
18、进一步优选地，步骤(1)中，所述煮沸的时间为15-45分钟。
19、一种真菌来源类外泌体纳米囊泡，通过上述的提取方法制得。
20、一种脂质纳米囊泡，由上述的真菌来源类外泌体纳米囊泡提取脂质，然后采用薄膜水化法制得。
21、上述真菌来源类外泌体纳米囊泡或上述脂质纳米囊泡在制备药物中的应用。
22、优选地，真菌来源类外泌体纳米囊泡或脂质纳米囊泡作为药物载体或药物活性成分。
23、优选地，真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物载体，药物还包括递送药物，所述递送药物包括蛋白、抗体、多肽、小分子化药、中药、核酸、外泌体、无机纳米颗粒、有机纳米颗粒中的至少一种；
24、优选地，真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物载体；所述药物为自身免疫性疾病药物、急性损伤药物、创口修复药物、肿瘤治疗药物、医美抗衰药物中的至少一种。
25、优选地，真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物活性成分；所述药物为预防酒精肝损伤药物或治疗银屑病药物中的一种。
26、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
27、本专利技术的真菌类外泌体纳米囊泡可以与植物类外泌体纳米囊泡、脂质体、哺乳动物细胞来源的细胞外囊泡或者外泌体联合治疗。
28、本专利技术的真菌来源类外泌体纳米囊泡可以通过挤压、冻融、超声的方法与植物类外泌体纳米囊泡、脂质体、哺乳动物细胞来源的细胞外囊泡或外泌体制备成杂合纳米囊泡。
29、本专利技术提取得到的可食用真菌类外泌体具有脂质双分子层结构，粒径分布均一，富含脂质、核酸、蛋白质和次级代谢产物，能够克服胃肠道屏障，在复杂多变的胃肠道环境中保持良好的生理活性，且无毒性。可用于大体积、低浓度样本中可食用真菌类外泌体的提取，填补了可食用真菌类外泌体研究的空白。
30、本专利技术的有益效果是：
31、本专利技术提供了一种普适性强、提取方法简单、成本低的可食用真菌类外泌体纳米囊泡的提取方法。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种真菌来源类外泌体纳米囊泡的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡的时间为6-24h；所述浸泡的温度为0-40℃；所述溶液的pH范围为5.8～7.8；所述溶液选自水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、TBS缓冲液、TBST缓冲液、TE缓冲液和Good's缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述真菌选自香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头菇、竹荪、松口蘑、白蘑、红菇、灵芝、雷丸、大红菇、松露、白灵菇、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌、块菌、干巴菌、冬虫夏草、白参菌、鸡枞菌、虎奶菇、紫丁香蘑、鸡油菌、松乳菇、奥德蘑、绣球菌、青头菌、珊瑚菌、黄柄鸡油菌、梭柄乳头菇、双孢蘑菇、长根菇、马勃、茯苓、猪苓、毛头鬼伞、金耳、云芝、树舌、拟小牛肝菌、紫芝、金针菇、杏鲍菇、平菇、松蘑、榛蘑、竹黄、蜜环菌、桑黄的中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述煮沸的时间为5-80分钟。
5.一种
6.一种脂质纳米囊泡，其特征在于，由权利要求5所述的真菌来源类外泌体纳米囊泡提取脂质，然后采用薄膜水化法制得。
7.权利要求5所述的真菌来源类外泌体纳米囊泡或权利要求6所述的脂质纳米囊泡在制备药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，真菌来源类外泌体纳米囊泡或脂质纳米囊泡作为药物载体或药物活性成分。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物载体，药物还包括递送药物，所述递送药物包括蛋白、抗体、多肽、小分子化药、中药、核酸、外泌体、无机纳米颗粒、有机纳米颗粒中的至少一种；真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物载体，所述药物为自身免疫性疾病药物、急性损伤药物、创口修复药物、肿瘤治疗药物、医美抗衰药物中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，真菌来源类外泌体纳米囊泡和脂质纳米囊泡作为药物活性成分；所述药物为预防酒精肝损伤药物或治疗银屑病药物中的一种。
...【技术特征摘要】
1.一种真菌来源类外泌体纳米囊泡的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡的时间为6-24h；所述浸泡的温度为0-40℃；所述溶液的ph范围为5.8～7.8；所述溶液选自水、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、tris-hcl缓冲液、tbs缓冲液、tbst缓冲液、te缓冲液和good's缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述真菌选自香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头菇、竹荪、松口蘑、白蘑、红菇、灵芝、雷丸、大红菇、松露、白灵菇、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌、块菌、干巴菌、冬虫夏草、白参菌、鸡枞菌、虎奶菇、紫丁香蘑、鸡油菌、松乳菇、奥德蘑、绣球菌、青头菌、珊瑚菌、黄柄鸡油菌、梭柄乳头菇、双孢蘑菇、长根菇、马勃、茯苓、猪苓、毛头鬼伞、金耳、云芝、树舌、拟小牛肝菌、紫芝、金针菇、杏鲍菇、平菇、松蘑、榛蘑、竹黄、蜜环菌、桑黄的中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述煮沸的时间为5-80分钟。
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