【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术属于生物检测，具体涉及用于异烟肼、利福平耐药型结核分枝杆菌检测的引物及探针及微阵列芯片。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌(tb)，是结核病的主要病原菌。结核病是一种发病率高，有强传染性的疾病。据世界卫生组织(who)报告，每年超1000万人感染结核分枝杆菌，约140万人死于结核病。且近年来，耐药结核病新增病例趋上升态势，耐药结核病的出现和传播给结核病的防控带来巨大挑战，已成为严重的公共卫生问题。面对这样的形势，亟需提高结核病检测水平，解决结核病防治中的棘手问题。
2、目前结核病的诊断方法包括临床症状评估、实验室检查和影像学检查。其中实验室检查主要包括痰涂片检查、结核菌培养和结核菌dna检测等。痰涂片检查虽然检测时间短，但灵敏度低、准确率低、假阳性率高，通常要求待测样本中结核分枝杆菌含量高于1000个/ml；培养法灵敏度特异性较高，但培养时间长，通常需要14-21天，不利于临床应用。
3、结核菌dna检测诊断时间较长，其样本——肺泡灌洗液获得过程需要麻醉，操作繁琐，从鼻腔进入肺部侵入感强。因此，市场上对于更快速、准确和便捷的结核病诊断方法以及耐药性菌种确定的需求仍然存在，结核病诊断市场具有巨大的潜力和需求。
4、目前已有使用pcr扩增的分子生物学检测方法检测结核分枝杆菌，具有灵敏度特异性高、快速等特点，但其使用痰液检测灵敏度特异性低，因此和培养法同样需要肺泡灌洗液进行检测。对于老人、儿
5、耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，mdr-tb)是指至少对异烟肼和利福平耐药的结核病，由于抗结核药物的广泛使用，尤其是不规范使用，导致耐药结核病的发生和传播。我国每年新发mdr-tb达12万例，占全球每年新发mdr-tb的25％，是全球第二大mdr-tb的高负担国家。目前我国结核病诊断方法中并无同时对结核分枝杆菌及其异烟肼、利福平耐药型进行检测的方法。
6、is6110是在结核分枝杆菌复合体中发现的一个多拷贝插入元件，其已成为区分结核分枝杆菌复合体和其他分枝杆菌的重要工具。is6110在结核病核酸诊断中广泛应用，但is6110在极少部分的菌株里存在缺失，这可能导致假阴性结果出现。
7、寡核苷酸微阵列芯片是由将寡核苷酸探针以阵列形式点样到处理过的、表面获得活性化学基团(如羟基、醛基或氨基)的玻璃片基上，探针与活性基团发生化学基团反应，形成稳定的共价键，将探针固定在玻璃片基上形成的。在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品dna通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、微量化、平行化、自动化、成本低的优点。因此，其已被广泛应用于诊断检测、差异表达分析、基因测序等诸多领域。
8、目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病的检测，但缺乏对结核分枝杆菌及其异烟肼、利福平耐药型并行检测的技术。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种用于结核分枝杆菌及其耐药型检测的引物、探针及微阵列芯片，本专利技术提供的引物、探针能够用于检测结核分枝杆菌及其异烟肼、利福平耐药型，具有灵敏度和准确度高、效率高、快速省时的特性，且能以痰液样本进行检测，无需侵入、无需麻醉。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种用于结核分枝杆菌及其耐药型检测的引物、探针，所述引物包括针对结核分枝杆菌is6110基因的引物、针对结核分枝杆菌mpt64基因的引物、针对耐异烟肼结核分枝杆菌katg基因s315t突变的引物、针对耐异烟肼结核分枝杆菌inha基因c15t突变的引物、针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531l和s531w突变的引物；所述探针包括针对结核分枝杆菌is6110基因的探针、针对结核分枝杆菌mpt64基因的探针、针对耐异烟肼结核分枝杆菌katg基因s315t突变的探针、针对耐异烟肼结核分枝杆菌inha基因c15t突变的探针、针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531l突变的探针、针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531w突变的探针；
4、所述针对结核分枝杆菌is6110基因的引物：
5、上游引物5'-gaagaatccgctgagataaagc-3′(seq id no.7)，
6、下游引物5'-ggttgatgtggtcgtagtaggt-3′(seq id no.8)；
7、所述针对结核分枝杆菌mpt64基因的引物：
8、上游引物5'-gacttctggtcggggtagtaac-3′(seq id no.9)，
9、下游引物5'-ctgtcgttttgctctgttgttc-3′(seq id no.10)；
10、所述针对耐异烟肼结核分枝杆菌katg基因s315t突变的引物：
11、上游引物5'-aagagctcgtatggcaccgg-3′(seq id no.11)，
12、下游引物5'-agcgccagcagggctcttc-3′(seq id no.12)；
13、所述针对耐异烟肼结核分枝杆菌inha基因c15t突变的引物：
14、上游引物5'-cgctgcccagaaaggga-3′(seq id no.13)，
15、下游引物5'-ccgggtttcctccggt-3′(seq id no.14)；
16、所述针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531l和s531w突变的引物：
17、上游引物5′-tggtccgcttgcacgagggtcaga-3′(seq id no.15)，
18、下游引物5′-ctcaggggtttcgatcgggcacat-3′(seq id no.16)；
19、针对结核分枝杆菌is6110基因的探针5'-tcacataaggcgttgtcgaggg-3'(seq idno.1)；
20、针对结核分枝杆菌mpt64基因的探针5'-tgtggtggccggcgtgtccgcc-3'(seq idno.2)；
21、针对耐异烟肼结核分枝杆菌katg基因s315t突变的探针5'-atcaccaccggcatc-3'(seq id no.3)；
22、针对耐异烟肼结核分枝杆菌inha基因c15t突变的探针5'-cgcggcgagatgatagg-3'(seq id no.4)；
23、针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531l突变的探本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于结核分枝杆菌及其耐药型检测的引物、探针，其特征在于，所述引物、探针包括针对结核分枝杆菌IS6110基因的引物、探针，针对结核分枝杆菌mpt64基因的引物、探针，针对耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因S315T突变的引物、探针，针对耐异烟肼结核分枝杆菌inhA基因C15T突变的引物、探针，针对耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因S531L突变的引物、探针，针对耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因S531W突变的引物、探针；
2.如权利要求1所述的引物、探针，其特征在于，所述探针的3'端都用荧光基团6-FAM标记，5'端都用猝灭基团BHQ1标记。
3.一种基于权利要求1所述探针、引物制备的用于检测结核分枝杆菌及其耐药型的微阵列芯片。
4.如权利要求3所述的微阵列芯片，其特征在于，所述微阵列芯片设置阳性对照区、阴性对照区、结核分枝杆菌IS6110基因分区、结核分枝杆菌mpt64基因分区、耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因S315T突变分区、耐异烟肼结核分枝杆菌inhA基因C15T突变分区、耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因S531L突变分区和耐利福平结
5.如权利要求4所述的微阵列芯片，其特征在于，所述阴性对照为0.067mol/L，pH 6.8磷酸盐缓冲液；所述阳性对照为含灭活结核分枝杆菌基因组DNA、IS6110基因探针、mpt64基因探针的PCR反应液。
6.如权利要求3所述的微阵列芯片，其特征在于，所述微阵列芯片除阴性对照区和阳性对照区外，分别固定相应的探针。
7.一种利用权利要求3所述微阵列芯片检测结核分枝杆菌及其耐药型的方法，所述的方法包括如下步骤：待测痰液样本提取基因组DNA，利用所述引物进行PCR扩增后，加入固定探针的微阵列芯片中，45℃恒温杂交3-4h；采用激光共聚焦扫描仪进行扫描，阴性对照区无荧光，阳性对照区有荧光，各个分区有荧光则代表待测样本含有相应的基因。
...【技术特征摘要】
1.一种用于结核分枝杆菌及其耐药型检测的引物、探针，其特征在于，所述引物、探针包括针对结核分枝杆菌is6110基因的引物、探针，针对结核分枝杆菌mpt64基因的引物、探针，针对耐异烟肼结核分枝杆菌katg基因s315t突变的引物、探针，针对耐异烟肼结核分枝杆菌inha基因c15t突变的引物、探针，针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531l突变的引物、探针，针对耐利福平结核分枝杆菌rpob基因s531w突变的引物、探针；
2.如权利要求1所述的引物、探针，其特征在于，所述探针的3'端都用荧光基团6-fam标记，5'端都用猝灭基团bhq1标记。
3.一种基于权利要求1所述探针、引物制备的用于检测结核分枝杆菌及其耐药型的微阵列芯片。
4.如权利要求3所述的微阵列芯片，其特征在于，所述微阵列芯片设置阳性对照区、阴性对照区、结核分枝杆菌is6110基因分区、结核分枝杆菌mpt64基因分区、耐异烟肼结核分枝杆菌kat...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈思异，徐箬瑄，方舟，李婷，
申请(专利权)人：湖州市民慧医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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