【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤的免疫治疗领域，尤其涉及一种基因工程化细菌外泌体及在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
技术介绍
1、肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的热点研究方向，旨在通过激活患者自身的免疫系统，启动免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，发挥抗肿瘤疗效。肿瘤新生抗原(neoantigen)是一类肿瘤细胞的基因组非同义突变产生的由肿瘤细胞特异表达的蛋白或多肽，能在机体中诱导强大的免疫反应，具有特异性强、副作用弱、安全性高等特点，现已成为肿瘤免疫治疗的重要靶点，基于肿瘤新生抗原的个性化免疫治疗模式被认为是未来实体瘤免疫治疗的主要发展方向。国内外多个临床试验的结果均揭示了以肿瘤新生抗原为靶点研发的肿瘤新生抗原疫苗在多种癌症治疗中的有效性和应用前景。研究表明，肿瘤新生抗原疫苗单药治疗虽可促使特异性淋巴细胞由外周血向肿瘤部位迁移，提升肿瘤组织中的免疫浸润，改善肿瘤免疫微环境，但同时也观察到新生抗原特异性淋巴细胞表面高表达pd-1、tim-3、ctla-4等受体，使免疫反应受到抑制，引起肿瘤免疫逃逸。因此，在接受新生抗原疫苗治疗，增加肿瘤内部新生抗原特异性淋巴细胞浸润的同时，联合免疫抑制疗法来抑制肿瘤细胞的免疫逃逸机制，可能是进一步提升肿瘤新生抗原疫苗疗效的关键手段。
2、mica/b是nkg2d的配体之一，广泛表达于肿瘤细胞表面。自然杀伤细胞可通过其表面表达的nkg2d受体来识别肿瘤细胞并激活对肿瘤细胞的杀伤程序，同时t淋巴细胞也可通过与肿瘤细胞表面的mica/b结合来释放共刺激信号，间接激活抗肿瘤免疫反应。但肿瘤细胞通过分泌金属蛋白
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的是提供一种递送蛋白的细菌外泌体囊泡，包括一种基因工程化细菌外泌体囊泡neo-micbomvs，表面载有由肿瘤新生抗原蛋白和micbα3结构域蛋白组成的融合蛋白。靶向抗原提呈细胞，促进免疫系统的激活，增加肿瘤微环境中的免疫浸润，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，提高肿瘤免疫治疗的效果。
2、本专利技术采用的技术方案是：一种表达载体，所述表达载体携带编码融合蛋白的核酸，所述编码融合蛋白的核酸含有编码大肠杆菌clya蛋白的核酸一、编码micbα3结构域蛋白的核酸二、编码fc蛋白的核酸三、编码抗原的核酸四和连接核酸一、核酸二、核酸三和核酸四的核酸五，所述核酸五用于编码furin蛋白酶识别位点。
3、所述表达载体是非致病性病毒载体。
4、所述核酸一如seq id no.1所示，所述核酸二如genbank:uik24483.1所示，所述核酸三如seq id no.2所示，所述抗原包括肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原，所述furin蛋白酶识别位点的氨基酸序列为rgrkrrs。
5、所述肿瘤新生抗原包括基于小鼠肝癌细胞系hepa1-6的7条短肽基因序列，所述编码肿瘤新生抗原的核酸四如seq id no:3所示。
6、所述编码融合蛋白的核酸含有如seq id no:4所示的核苷酸序列。
7、一种基因工程化细菌外泌体，所述外泌体囊泡的表面载有或可分泌所述表达载体表达的融合蛋白。
8、所述融合蛋白由肿瘤新生抗原蛋白、micbα3结构域蛋白、fc蛋白和furin蛋白酶识别位点组成。
9、一种制备基因工程化细菌外泌体囊泡的方法，包括如下制备步骤：
10、(1)外泌体囊泡制备：将所述表达载体转化至大肠杆菌，并在lb平板中过夜培养，取单克隆菌落在lb培养基中培养；
11、(2)外泌体囊泡提取：取步骤(1)中培养完成的lb培养基，离心去除培养基中的大肠杆菌，将上清液过滤，并在超速离心机中离心，收集外泌体。
12、所述的细菌外泌体囊泡均来源于工程化大肠杆菌rosetta菌株，细菌膜表面表达有肿瘤新生抗原蛋白和micbα3结构域蛋白。所述的细菌外泌体囊泡由大肠杆菌rosetta分泌，通过超速离心获得。
13、本专利技术首先将大肠杆菌clya蛋白基因序列、肿瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3蛋白基因序列和fc蛋白基因序列插入pet28a空载质粒中，并在3’端插入3×ha序列得到质粒(pet28a-clya-neo-micb-fc)。将上述质粒转化至大肠杆菌rosetta菌株中，诱导融合蛋白表达，通过超速离心提取细菌外泌体，最后通过western blot验证融合蛋白的表达情况。
14、具体的，所述载有目的融合蛋白的细菌外泌体囊泡由如下方法构建获得：
15、(1)外泌体囊泡制备：将大肠杆菌clya蛋白基因序列、肿瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3结构域蛋白基因序列和fc蛋白基因序列通过柔性肽序列链接构成新的融合蛋白基因序列，再插入到pet28a空载质粒(或其他用于表达融合蛋白空载质粒)中，获得pet28a-clya-neo-micb-fc质粒，将表达质粒转化至大肠杆菌rosetta，并在添加有kanamycin的lb平板中过夜培养，取单克隆菌落在添加有kanamycin的lb培养基中培养，待培养基od值在0.6～0.8之间时加入iptg继续培养。
16、(2)外泌体囊泡提取：取培养完成的lb培养基，离心去除培养基中的大肠杆菌rosetta，将上清液依次在0.45nm和0.22nm的滤头中过滤，并在超速离心机中离心，收集外泌体，使用蛋白定量bca法进行总蛋白定量，可通过western blot检测目的融合蛋白的表达，证明载有肿瘤新生抗原和micbα3结构域蛋白的融合蛋白的细菌外泌体囊泡成功构建。
17、本专利技术运用基因工程策略将肿瘤新生抗原蛋白基因序列、micbα3结构域蛋白基因序列和fc蛋白基因序列用furin蛋白酶切割序列连接组成融合蛋白基因序列，并在大肠杆菌rosetta中诱导表达以得到细菌外泌体囊泡neo-micbomvs。外泌体囊泡中携带的融合蛋白可在体内被furin蛋白酶切割得到肿瘤新生抗原蛋白和micbα3结构域蛋白。肿瘤新生抗原蛋白可被抗原提呈细胞处理并将抗原信息呈递至t淋巴细胞，诱导新生抗原特异性t细胞的激活，特异性识别杀伤肿瘤细胞；micbα3结构域蛋白可被b细胞吞噬，并诱导产生针对micbα3结构域蛋白的抗体，该抗体可与肿瘤细胞表面的micb蛋白结合，阻止micb蛋白的脱落，抑制相关免疫逃逸机制；fc蛋白可增加外泌体囊泡与靶细胞的结合能力，促进外泌体囊泡的吞噬；外泌体囊泡具有lp本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达载体，其特在于，所述表达载体携带编码融合蛋白的核酸，所述编码融合蛋白的核酸含有编码大肠杆菌ClyA蛋白的核酸一、编码MICBα3结构域蛋白的核酸二、编码Fc蛋白的核酸三、编码抗原的核酸四和连接核酸一、核酸二、核酸三和核酸四的核酸五，所述核酸五用于编码Furin蛋白酶识别位点。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特在于，所述核酸一如SEQ IDNo.1所示，所述核酸二如GenBank:UIK24483.1所示，所述核酸三如SEQ IDNo.2所示，所述抗原包括肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原，所述Furin蛋白酶识别位点的氨基酸序列为RGRKRRS。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述肿瘤新生抗原包括基于小鼠肝癌细胞系Hepa1-6的7条短肽基因序列，编码肿瘤新生抗原的核酸四序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特在于，所述编码融合蛋白的核酸含有如SEQ IDNO:4所示的
6.一种基因工程化细菌外泌体囊泡，其特征在于，所述外泌体囊泡的表面载有或可分泌如权利要求1～4任一项表达载体表达的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的外泌体，其特征在于，所述融合蛋白由肿瘤新生抗原蛋白、MICBα3结构域蛋白、Fc蛋白和Furin蛋白酶识别位点组成。
8.一种制备权利要求7所述的基因工程化细菌外泌体囊泡的方法，包括如下制备步骤：
9.一种疫苗组合物，包括权利要求6～7任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的运载体。
10.一种抑制肿瘤细胞表面MICB蛋白脱落的方法，其特征在于，给予由此需要的对象施加有效量的权利要求6所述的外泌体囊泡或权利要求9所述的药物组合物。
...【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特在于，所述表达载体携带编码融合蛋白的核酸，所述编码融合蛋白的核酸含有编码大肠杆菌clya蛋白的核酸一、编码micbα3结构域蛋白的核酸二、编码fc蛋白的核酸三、编码抗原的核酸四和连接核酸一、核酸二、核酸三和核酸四的核酸五，所述核酸五用于编码furin蛋白酶识别位点。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特在于，所述核酸一如seq idno.1所示，所述核酸二如genbank:uik24483.1所示，所述核酸三如seq idno.2所示，所述抗原包括肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原，所述furin蛋白酶识别位点的氨基酸序列为rgrkrrs。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述肿瘤新生抗原包括基于小鼠肝癌细胞系hepa1-6的7条短肽基因序列，...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志雄，刘小龙，曾永毅，叶鸿昊，唐瑞璟，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院，
类型：发明
国别省市：
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