【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗肌肉或神经肌肉系统疾病的药物，具体涉及一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体、药物组合物。
技术介绍
1、mirna-486是主要来源于骨骼肌且在骨骼肌中表达丰度较高的一种myomirs(张文典.micrornas与肌肉减少症[j].生物医学化,2022,3(01):67-69)。microrna-486是一种茎环序列嵌入ankyrin1(ank1)位点的mirna，在哺乳动物中严格保守。研究表明microrna-486极有潜力成为通过运动干预改善肌肉萎缩的治疗靶点(qiu d,zhangy,ni p,etal.muscle-enriched microrna-486-mediated regulation ofmuscular atrophy andexercise[j].journal of physiology and biochemistry,2024:1-15.)。
2、然而，将治疗性基因输送到体内特定细胞一直具有挑战性，特别是在大型解剖分布的组织(如骨骼肌)中。然而，缺乏肌肉细胞特异性会导致不可预测的全身不良反应。因此，需要探索靶向策略来提高药物疗效，减少副作用，如何有效地将药物递送到骨骼肌仍然是一个非常重要的课题。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，该特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相
2、本专利技术的目的之二在于提供一种重组腺相关病毒载体系统，该重组腺相关病毒载体系统能够成功包装腺相关病毒，腺相关病毒的衣壳蛋白是aav1或者aav7血清型，能够选择性靶向骨骼肌细胞。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种rgd基序修饰的重组腺相关病毒，该rgd基序修饰的重组腺相关病毒的衣壳蛋白上的纤维蛋白连接rgd基序。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种药物组合物，在提高腺相关病毒递送效率的同时，还可以减少腺相关病毒的免疫原性，降低其在体内的清除率，从而提高治疗效果，提高脂质体的靶向性。
5、本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
6、本专利技术目的之一提供一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含包装启动子、外源基因、sv40 polya、骨骼肌特异性启动子、mirna-486基因编码序列，所述骨骼肌特异性启动子控制mirna-486基因编码序列的表达。
7、进一步地，所述骨骼肌特异性启动子为mck(肌酸激酶)启动子、3×enhancer mck、myog启动子、sm22a启动子、acta1(α-肌动蛋白)启动子、mhck7启动子中的一种。
8、进一步地，所述包装启动子为cmv(巨细胞病毒)启动子和pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子中的一种。
9、本专利技术目的之二提供一种重组腺相关病毒载体系统，包括所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体和腺病毒基因组质粒，所述腺病毒基因组质粒包括aav1或者aav7的衣壳蛋白基因。
10、进一步地，所述腺病毒基因组质粒的腺病毒基因组的e4区域附近为纤维基因，所述纤维基因中插入spytag序列。
11、进一步地，所述腺病毒基因组质粒的腺病毒基因组的e4区域附近为纤维基因，所述纤维基因中的hi环区域插入rgd序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。
12、本专利技术目的之三提供一种rgd基序修饰的重组腺相关病毒，由所述的一种重组腺相关病毒载体系统共转染包装细胞系获得，获得的重组腺相关病毒粒子与spycatcher融合的rgd基序共价修饰，得到所述rgd基序修饰的重组腺相关病毒。
13、本专利技术目的之四提供一种药物组合物，包括所述的一种rgd基序修饰的重组腺相关病毒、阳离子脂质体纳米颗粒和纳米微泡，所述阳离子脂质体纳米颗粒的囊内包被所述rgd基序修饰的重组腺相关病毒及所述纳米微泡。
14、进一步地，还包括il6r特异性激动剂抗体，所述il6r特异性激动剂抗体为mt-18；所述阳离子脂质体纳米颗粒的表面用所述rgd基序修饰，所述修饰方法包括以下步骤：
15、将rgd基序和半胱氨酸在转肽酶的酶催化作用下，将半胱氨酸连接到rgd基序上，再与顺丁烯二酰亚胺试剂反应，形成稳定的硫醚键，通过所述硫醚键偶联到所述阳离子脂质体纳米颗粒表面。
16、进一步地，所述纳米微泡的制备方法包括以下步骤：
17、s1、纳米微泡和微米微泡的微流控生产：将dppc(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱)和dspe-peg2000(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])以95:5的摩尔比混合，配制成总脂质浓度为2mg/ml的混合物；
18、s2、将脂质溶解在1:1的氯仿和甲醇混合物中，在氮气下干燥以去除溶剂，然后在含有1％(v/v)甘油的磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中重悬，然后将脂质溶液与c4f10(pfb)气体在多路微喷雾微流控装置中结合以产生气泡；
19、s3、纳米微泡的分离：1h后，用注射器和细针将纳米气泡样品从瓶底取出，然后用800nm聚四氟乙烯(ptfe)膜过滤，去除任何大气泡，得到所述纳米微泡。
20、相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
21、本专利技术提供的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，载体上包含包装启动子和骨骼肌特异性启动子，包装启动子用于包装腺相关病毒，骨骼肌特异性启动子包装的腺相关病毒感染骨骼肌细胞后能够在组织特异性启动子的作用下表达mirna-486基因；外源基因例如gfp(绿色荧光蛋白)用于在荧光显微镜下观察重组腺相关病毒载体系统的转染效率。
22、本专利技术提供的一种rgd基序修饰的重组腺相关病毒，该rgd基序修饰的重组腺相关病毒的衣壳蛋白上的纤维蛋白连接rgd基序，rgd基序能够与骨骼肌细胞表面上的整合素异源二聚体受体结合，提高了重组腺相关病毒感染骨骼肌细胞的能力。
23、本专利技术的目的之四在于提供一种药物组合物，将腺相关病毒包被在阳离子脂质体纳米颗粒的囊内，在提高腺相关病毒递送效率的同时，还可以减少腺相关病毒的免疫原性，降低其在体内的清除率，从而提高治疗效果，并且所述阳离子脂质体纳米颗粒表面用所述rgd基序修饰，同时提高阳离子脂质体纳米颗粒的靶向性。
24、本专利技术的目的之四在于提供一种药物组合物，所述阳离子脂质体纳米颗粒的囊内包被纳米微泡，纳米泡在超声作用下，在高强度聚焦超声(hifu)过程中，样品温度也被发现高于预测阈值，使得pfb液滴经历了从液体到气体状态的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带miRNA-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含包装启动子、外源基因、SV40 polyA、骨骼肌特异性启动子、miRNA-486基因编码序列，所述骨骼肌特异性启动子控制miRNA-486基因编码序列的表达。
2.如权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带miRNA-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述骨骼肌特异性启动子为MCK启动子、3×enhancerMCK、MYOG启动子、SM22a启动子、ACTA1启动子、MHCK7启动子中的一种。
3.如权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带miRNA-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述包装启动子为CMV启动子和PGK启动子中的一种。
4.一种重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，包括权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带miRNA-486基因的腺相关病毒载体和腺病毒基因组质粒，所述腺病毒基因组质粒包括AAV1或者AAV7的衣壳蛋白基因。
5.如权利要求4所述的一种重组腺相关病毒载体系统，其特
6.如权利要求4所述的一种重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺病毒基因组质粒的腺病毒基因组的E4区域附近为纤维基因，所述纤维基因中的HI环区域插入RGD序列。
7.一种RGD基序修饰的重组腺相关病毒，其特征在于，由权利要求4所述的一种重组腺相关病毒载体系统共转染包装细胞系获得，获得的重组腺相关病毒粒子与SpyCatcher融合的RGD基序共价修饰，得到所述RGD基序修饰的重组腺相关病毒。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求7所述的一种RGD基序修饰的重组腺相关病毒、阳离子脂质体纳米颗粒和纳米微泡，所述阳离子脂质体纳米颗粒的囊内包被所述RGD基序修饰的重组腺相关病毒及所述纳米微泡。
9.如权利要求8所述的一种药物组合物，其特征在于，还包括IL6R特异性激动剂抗体，所述IL6R特异性激动剂抗体为MT-18；所述阳离子脂质体纳米颗粒的表面用所述RGD基序修饰，该修饰方法包括以下步骤：
10.如权利要求8所述的一种药物组合物，其特征在于，所述纳米微泡的制备方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含包装启动子、外源基因、sv40 polya、骨骼肌特异性启动子、mirna-486基因编码序列，所述骨骼肌特异性启动子控制mirna-486基因编码序列的表达。
2.如权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述骨骼肌特异性启动子为mck启动子、3×enhancermck、myog启动子、sm22a启动子、acta1启动子、mhck7启动子中的一种。
3.如权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体，其特征在于，所述包装启动子为cmv启动子和pgk启动子中的一种。
4.一种重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，包括权利要求1所述的一种特异性靶向骨骼肌细胞的携带mirna-486基因的腺相关病毒载体和腺病毒基因组质粒，所述腺病毒基因组质粒包括aav1或者aav7的衣壳蛋白基因。
5.如权利要求4所述的一种重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺病毒基因组质粒的腺病...
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