【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞外囊泡制备，涉及一种球根植物细胞外囊泡及其制备方法和应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡是一类具有脂质膜包被的囊泡，其内包裹着蛋白质、脂质、核酸等活性大分子，由细胞分泌到质外体，对细胞间的交流至关重要。植物细胞外囊泡具有丰富的核酸、蛋白质等生物活性物质。与动物来源的细胞外囊泡相比，植物细胞外囊泡因来源于可食用植物，因此不仅无毒，且产率高、生物相容性好、具有非免疫原性。研究表明，从多种可食用植物中提取的细胞外囊泡具备抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等多种治疗作用，具有研发为药物制剂并高效治疗一系列疾病的药用潜力。此外，具有生物活性的植物细胞外囊泡还可作为载体递送核酸、多糖、蛋白质等生物大分子，用于封装药物并协同增强其治疗效果。
2、现有技术中，植物来源细胞外囊泡多提取自富含汁液的水果或花朵、叶片等组织。以百合、石蒜等球根植物为代表的具有膨大地下贮藏器官的多年生植物通常淀粉含量高，破壁后汁液少且粘稠，难以通过常规细胞外囊泡提取方法获得球根植物细胞外囊泡。且百合、石蒜、黄精等具膨大地下贮藏器官的中草药通常需经风干、炮制后方才发挥疗效，但风干、炮制是否会导致所得细胞外囊泡纯度、粒度、形态和成分发生变化，目前尚不明确。因此，迫切需要一种针对具膨大地下贮藏器官的多年生植物的、简单且高效制备高质量细胞外囊泡的方法。
3、中国专利技术专利cn114540271a提供了一种植物外泌体的纯化方法，包括：收集植物细胞破碎液，离心收集上清液；向上清液中加入沉淀液，得混合液；将混合液离心，弃上清，收集沉淀，加入pbs完全溶
4、中国专利技术专利cn118424819a提供了一种植物外泌体及其提取方法，将植物茎叶破壁后通过过滤、低速离心、微孔滤膜过滤、超速离心、重悬、超速离心、重悬、微孔滤膜过滤分离得到植物外泌体。采用该技术植物外泌体的提取方法提取淫羊藿外泌体，提取过程使用的试剂种类单一，仪器数量少，无需大量的细胞培养液即可获得尺寸在130nm左右的淫羊藿外泌体。并且淫羊藿外泌体的产率和纯度均较高，从150g淫羊藿茎叶中约可提取出5×1012个外泌体，且粒径分布均匀，集中于130nm，有利于后续生产或研究。但是该技术没有提供一种针对淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物膨大地下贮藏器官中细胞外囊泡的提取方法。
5、中国专利技术专利cn118546855a提供了一种植物外泌体及其提取方法。所述的植物外泌体的提取方法包括：（a）向植物组织匀浆中加入蛋白酶抑制剂，得到初榨汁液；将初榨汁液进行连续离心处理，取上清，得到预处理汁液；（b）将聚乙二醇和葡聚糖添加至预处理汁液后进行震荡处理和第一离心，收集下层的纳米颗粒悬液；（c）将纳米颗粒悬液进行尺寸排阻色谱，收集目标产物；（d）可选地，将聚乙二醇和目标产物混匀后进行孵育和第二离心，收集沉淀产物。所述的植物外泌体的提取方法，具有普适性，简单快捷，无需特殊设备，易于控制，可得到大小均匀的外泌体，所获得的外泌体具有较高的浓度，成本低，可适用于大规模生产。但是该技术没有提供一种针对淀粉含量高、汁液量少粘稠的鳞茎植物中细胞外囊泡的提取方法。
6、总之，现有技术尚不能提供一种淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物地下膨大器官中更高效的细胞外囊泡提取方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，针对现有技术尚不能提供一种淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物地下膨大器官中更高效的细胞外囊泡的提取方法的问题，本专利技术提供了一种球根植物细胞外囊泡及其制备方法和应用。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种球根植物细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、将球根植物组织与缓冲溶液混合，粉碎，过滤，得植物原液；
4、s2、将步骤s1得到的植物原液进行处理，得植物清液；
5、s3、将步骤s2得到的植物清液于3-5℃、110000-130000g的条件下离心80-100min，保留沉淀，使用缓冲溶液重悬沉淀，重复1-2次，得重悬液；
6、s4、将步骤s3得到的重悬液过滤，滤液浓缩，得球根植物细胞外囊泡；
7、其中，所述球根植物组织选自百合或石蒜；
8、步骤s2中所述处理包括以下步骤：
9、s201、将步骤s1得到的植物原液于3-5℃、900-1100g离心8-12min，得上清液1；
10、s202、将步骤s201得到的上清液1于3-5℃、2900-3100g离心18-22min，得上清液2；
11、s203、将步骤s202得到的上清液2与半纤维素酶、果胶酶和纤维素酶混合，得酶混合液，室温静置消化2-3小时获得上清液3，于3-5℃、4900-5100g离心100-140min，得上清液3；
12、s204、将步骤s203得到的上清液3使用滤膜过滤，得滤液1；
13、s205、将步骤s204得到的滤液1于3-5℃、19000-21000g离心80-100min，得上清液4；
14、s206、将步骤s205得到的上清液4使用滤膜过滤，得植物清液。
15、优选地，步骤s1中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液pbs，所述缓冲溶液的ph值为7.2-7.4，所述球根植物组织的质量与所述缓冲溶液的体积为1-4:4，单位为g:ml。
16、优选地，步骤s1中，所述粉碎的温度为3-5℃，所述粉碎的时间为2-5min，所述过滤为使用纱布过滤。
17、优选地，步骤s2中所述处理包括以下步骤：
18、s201、将步骤s1得到的植物原液于4℃、1000g离心10min，得上清液1；
19、s202、将步骤s201得到的上清液1于4℃、3000g离心20min，得上清液2；
20、s203、将步骤s202得到的上清液2与半纤维素酶、果胶酶和纤维素酶混合，得酶混合液，室温静置消化2-3小时，于4℃、5000g离心120min，获得上清液3；
21、s204、将步骤s203得到的上清液3依次使用0.8μm滤膜和0.45μm滤膜过滤，得滤液1；
22、s205、将步骤s204得到的滤液1于4℃、20000g离心90min，得上清液4；
23、s206、将步骤s205得到的上清液4使用0.22μm滤膜过滤，得植物清液；
24、其中，步骤s203中，所述半纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.1%-0.3%，所述果胶酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.05%-0.15%，所述纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.05%-0.15%。
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1.一种球根植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液PBS，所述缓冲溶液的pH值为7.2-7.4，所述球根植物组织的质量与所述缓冲溶液的体积为1-4:4，单位为g:mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述粉碎的温度为3-5℃，所述粉碎的时间为2-5min，所述过滤为使用纱布过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述处理包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S203中，所述半纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.2%，所述果胶酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.1%，所述纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.1%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将步骤S2得到的植物清液于4℃、120000g的条件下离心90min，保留沉淀，使用磷酸盐缓冲溶液PBS重悬沉淀，重复1-2次，得重悬液。
7.根据权利要求1
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述滤液浓缩的比例为：每200g新鲜植物组织浓缩为0.2-0.8mL的浓缩液；步骤S4中，所述滤液浓缩之后，还包括柱色谱提取；
9.权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得的球根植物细胞外囊泡。
10.权利要求1-8中任意一项所述的制备方法在生产植物细胞外囊泡中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种球根植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液pbs，所述缓冲溶液的ph值为7.2-7.4，所述球根植物组织的质量与所述缓冲溶液的体积为1-4:4，单位为g:ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述粉碎的温度为3-5℃，所述粉碎的时间为2-5min，所述过滤为使用纱布过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述处理包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s203中，所述半纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.2%，所述果胶酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.1%，所述纤维素酶在所述酶混合液中的质量浓度为0.1%。
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡逸飞，任梓铭，谢绪艳，蓝洲，黄楠，王敬茹，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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