【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物检测，尤其涉及一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测组合物、方法及试剂盒。
技术介绍
1、昆虫病毒作为一类以昆虫为宿主并能使昆虫致病的病毒，其以昆虫作为媒介，同时也能够感染人类及其他哺乳动物，引发疫病，严重可导致死亡。昆虫细胞被广泛应用于在生物医药领域中，包括high five细胞、sf9细胞、d.mel-2细胞在内的昆虫细胞常被用于病毒疫苗、重组蛋白以及病毒载体的生产中，因此昆虫细胞中的外源病毒感染被认为是一项主要的安全性问题。
2、常见的能够感染昆虫细胞的rna病毒包括弹状病毒科、诺达病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科等，而比较具有代表性的病毒包括被报道能感染sf细胞系的sf弹状病毒、能够感染high five细胞的兽棚病毒变异株、包括牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒在内的哺乳动物病毒、以及脑心肌炎病毒、松毛虫ω病毒、白蛉热病毒等。
3、目前传统的昆虫病毒检测方法一般包括生物学测定法、电子显微镜观察、基于酶联免疫吸附反应的血清学方法、基于核酸分析的pcr检测方法等，普遍存在检测灵敏度低、特异性差等情况，同时传统的qpcr方法多采用单独的检测试剂盒，操作繁琐、耗时长、容易出现假阳性或无法覆盖较全的病毒种类，不同病毒检测反应体系及程序相差较大，无法满足多种病毒同时检测的需求。同时常见的rna病毒检测方法在rna抽提、反转等过程中没有较好的质控品，传统的qpcr选择的标准品多为质粒，并能不够比较真实的反应rna病毒的状态。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测组合物、方法及试剂盒，可以准确、快速的检测样品中的昆虫病毒。
2、为了实现上述目的，本申请采用了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测组合物，所述检测组合物包括检测如下rna病毒的引物和探针：
4、检测sf弹状病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：1所示，下游引物如seq idno：2所示，探针如seq id no：3所示；
5、检测兽棚病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：4所示，下游引物如seq idno：5所示，探针如seq id no：6所示；
6、检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：7所示，下游引物如seq id no：8所示，探针如seq id no：9所示；
7、检测猪瘟病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：10所示，下游引物如seq idno：11所示，探针如seq id no：12所示；
8、检测乙脑病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：13所示，下游引物如seq idno：14所示，探针如seq id no：15所示；
9、检测果蝇x病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：16所示，下游引物如seq idno：17所示，探针如seq id no：18所示；
10、检测脑心肌炎病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：19所示，下游引物如seqid no：20所示，探针如seq id no：21所示；
11、检测松毛虫ω病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：22所示，下游引物如seqid no：23所示，探针如seq id no：24所示；
12、检测白蛉热病毒的引物和探针：上游引物如seq id no：25所示，下游引物如seqid no：26所示，探针如seq id no：27所示。
13、第二方面，本专利技术提供了一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述检测组合物。
14、探针的荧光基团为fam、vic或cy5，淬灭基团选择bhq1或bhq2。
15、在以上技术方案中，所述检测试剂盒包含阳性对照品、阴性对照品以及荧光定量pcr反应试剂。
16、在以上技术方案中，所述荧光定量pcr反应试剂为荧光定量pcr反应预混液，包括2×one step rt-pcr bufferⅲ、ex taq hs、rt enzyme mixⅱ、rox reference dye内参染料、无核酶水、以及上述检测组合物。
17、在以上技术方案中，所述阳性对照品包含阳性rna标准品，浓度均为2×108copies/μl。
18、在以上技术方案中，所述检测试剂盒中的荧光定量pcr反应体系为20μl，包含15μl的所述荧光定量pcr反应预混液和5μl的模板；所述模板为待测样品的rna、阳性对照标准品和阴性对照标准品。
19、在以上技术方案中，所述反应体系的反应条件为：42℃反转5min；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
20、第三方面，本专利技术提供了一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测方法，所述检测方法非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
21、(1)提取待测样品的rna模板；
22、(2)采用上述检测组合物建立荧光定量pcr反应体系；
23、(3)进行荧光定量pcr检测；
24、(4)待测样品的结果分析。
25、在以上技术方案中，所述荧光定量pcr反应体系为20μl，包含15μl的荧光定量pcr反应预混液和5μl的模板；所述模板为待测样品的rna、阳性对照标准品和阴性对照标准品；所述荧光定量pcr反应预混液包括2×one step rt-pcr bufferⅲ、ex taq hs、rt enzymemixⅱ、rox reference dye内参染料、无核酶水、以及上述检测组合物。
26、在以上技术方案中，所述荧光定量pcr反应体系的反应条件为：42℃反转5min；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
27、本专利技术的有益效果在于：
28、1、本专利技术旨在检测能够感染昆虫细胞的多种rna病毒，通过数据库分析比对分析，寻找病毒基因组保守序列，设计具有较强特异性的引物探针，可检出该病毒的绝大部分亚型。
29、2、本专利技术所述检测组合物，其中探针荧光报告基团可选择fam、vic或cy5，荧光淬灭基团选择bhq1或bhq2，即可满足检测上述任意一种的rna病毒，同时可检测任意组合的rna病毒。
30、3、通过对病毒保守区域设计多对探针引物，最终筛选特异性好、灵敏度高的引物探针，可准确定量2×107copies/μl至20copies/μl的病毒含量，大部分病毒检测灵敏度能达到10copies/μl，部分病毒最低灵敏度可达2copies/μl。
31、4、本专利技术所述检测昆虫细胞中多种rna病毒的检测试剂盒，含有用于检测的阳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测昆虫细胞中多种RNA病毒的多重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于：所述检测组合物包括检测如下RNA病毒的引物和探针：
2.一种用于检测昆虫细胞中多种RNA病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含权利要求1所述检测组合物。
3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含阳性对照品、阴性对照品以及荧光定量PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR反应试剂为荧光定量PCR反应预混液，包括2×One Step RT-PCRBufferⅢ、Ex Taq HS、RT Enzyme MixⅡ、ROXReference Dye内参染料、无核酶水、以及权利要求1所述检测组合物。
5.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品包含阳性RNA标准品，浓度均为2×108copies/μL。
6.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中的荧光定量PCR反应体系为20μL，包含15μL的所述荧光定量PCR反应预混液和
7.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于：所述反应体系的反应条件为：42℃反转5min；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
8.一种用于检测昆虫细胞中多种RNA病毒的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述检测方法非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应体系为20μL，包含15μL的荧光定量PCR反应预混液和5μL的模板；所述模板为待测样品的RNA、阳性对照标准品和阴性对照标准品；所述荧光定量PCR反应预混液包括2×One Step RT-PCR BufferⅢ、ExTaq HS、RT Enzyme MixⅡ、ROX Reference Dye内参染料、无核酶水、以及权利要求1所述检测组合物。
10.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应体系的反应条件为：42℃反转5min；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测组合物，其特征在于：所述检测组合物包括检测如下rna病毒的引物和探针：
2.一种用于检测昆虫细胞中多种rna病毒的多重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含权利要求1所述检测组合物。
3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含阳性对照品、阴性对照品以及荧光定量pcr反应试剂。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量pcr反应试剂为荧光定量pcr反应预混液，包括2×one step rt-pcrbufferⅲ、ex taq hs、rt enzyme mixⅱ、roxreference dye内参染料、无核酶水、以及权利要求1所述检测组合物。
5.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品包含阳性rna标准品，浓度均为2×108copies/μl。
6.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中的荧光定量pcr反应体系为20μl，包含15μl的所述荧光定量pcr反应预混液和5μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，曾炜佳，高志建，陈惠，胡孟军，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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