【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体地，涉及一种重组慢病毒载体及其制剂。
技术介绍
1、艾滋病，亦称为获得性免疫缺陷综合征，是一种威胁人类生命安全的重大传染病，由人类免疫缺陷病毒(hiv)引起。hiv是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它以人体免疫系统中的cd4阳性的t淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，从而易于感染各种疾病，甚至发生恶性肿瘤，病死率较高。
2、目前尚无有效的艾滋病疫苗问世，临床主要使用高效联合抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，haart)，俗称“鸡尾酒疗法”，也称抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy，art)。现有的art治疗并不能清除hiv-1的病毒潜藏库，均需终身服药，一旦停药病毒储藏库中的病毒可再度激活、复制，于是疾病会迅速反弹，因此需要患者永久用药。
3、而要实现功能性治愈，可以利用广谱中和性抗体，还可以基于抗体开发多特异性的分子以及利用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，car)改造t细胞。但很多毒株已对这类抗体产生抗性，必须克服这种耐药性才能获得最佳的临床效果。治愈艾滋病的另一个思路，是重新激活潜伏的hiv，并通过联合增强机体hiv特异性免疫应答的方法，弥补hiv对机体造成的免疫损伤，增强对hiv储藏库的清除效果。而相关研究最终以失败而告终。其原因一方面是由于所述car-t细胞本身特异性杀伤力有待提高，另一方面是所述car-t细胞本身亦容易受到hiv
4、目前仍需要积极手段来实现艾滋病的功能性治愈，乃至清除潜伏库，最终实现根除治愈。
5、基因治疗或细胞治疗为治疗基因缺陷疾病以及病毒感染等引起的多种疾病提供了一种新的思路和解决方案，随着一些重大疾病的基因治疗或细胞治疗获得成功，标志着基因治疗或细胞治疗已取得重大突破。随着基因治疗或细胞治疗技术在人类疾病方面的发展，病毒载体得到越来越多的应用。其中，重组慢病毒作为基因治疗载体，可感染分裂和非分裂细胞，并能将外源基因整合到宿主基因组中实现长期稳定表达，具有宿主范围广、免疫原性低、基因组容量大、可以长期表达等多种优势。
6、然而，慢病毒载体的稳定性很低，而应用于人体治疗的慢病毒载体必须维持其结构完整性才能保持生物活性。为了维持慢病毒载体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。
7、慢病毒载体生物活性的丧失多发生在贮存保藏阶段，携带目的基因的重组慢病毒载体一般制成液体制剂在超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度稳定的主要挑战之一就是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。
8、慢病毒载体一般包括病毒基因组以及病毒基因组编码的外壳蛋白，还包括脂双层包被膜结构。在超低温条件下，脂双层在冷冻期间易遭破坏，蛋白质易受到变性的影响，因而一般情况下慢病毒载体制剂不宜在超低温条件下长久保存。
9、超低温保存的时间过长、在使用过程中反复冻融、或者使用不当使所述制剂在达到靶器官之前过长时间地暴露于有机体体温(例如人体或其他动物体体温)或室温下，重组慢病毒载体的生物活性(一般以病毒滴度来表示)往往会迅速大幅下降，从而直接影响到重组慢病毒载体制剂的治疗效果或者使临床前研究以及临床研究的结果不准确。
10、虽然现有技术中已经公开了一些慢病毒载体制剂，但其在不同条件下的稳定性仍有待提高，因此亟需一种稳定性更好的重组慢病毒载体制剂，在-80℃超低温条件下能长时间保存，以及在较长时间暴露于2-8℃或有机体体温后，仍然能够更好地保持符合使用要求的重组慢病毒载体活性。
技术实现思路
1、一方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒载体，其包含(1)靶向hiv的嵌合抗原受体(car)的编码序列，和/或(2)靶向hiv基因的shrna的编码序列。
2、在一些具体实施方案中，所述car包含胞外区、跨膜区及胞内区。在一些优选实施方案中，所述胞外区可特异性结合hiv的gp120蛋白。在一些更优选的实施方案中，所述胞外区包含人cd4分子的d1和d2结构域。在另一些更优选的实施方案中，所述car的氨基酸序列如seq id no：24-29任一所示，进一步优选地，如seq id no：25所示。
3、在一些具体实施方案中，所述shrna包括靶向gag的shrna和靶向ltr的shrna。在一些优选实施方案中，所述靶向gag的shrna的核苷酸序列如seq id no：1所示，靶向ltr的shrna的核苷酸序列如seq id no：2所示序列。在一些优选实施方案中，所述靶向gag的shrna的编码序列如seq id no：3所示，靶向ltr的shrna的编码序列如seq id no：4所示。
4、另一方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒载体制剂，其中，所述制剂包括：a)重组慢病毒载体；b)组氨酸盐酸盐缓冲液；c)葡萄糖和蔗糖；d)表面活性剂。
5、葡萄糖和蔗糖
6、在一些具体实施方案中，所述葡萄糖和蔗糖在制剂中的总浓度为1-15％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述葡萄糖和蔗糖在制剂中的总浓度优选为3-13％(w/v)，更优选为5-8％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述葡萄糖和蔗糖在制剂中的总浓度为5.0％(w/v)、5.5％(w/v)、6.0％(w/v)、6.5％(w/v)、7.0％(w/v)、7.5％(w/v)、8.0％(w/v)，最优选6.0％(w/v)、6.5％(w/v)、7.0％(w/v)。
7、在一些具体实施方案中，所述葡萄糖在制剂中的浓度为1-10％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述葡萄糖在制剂中的浓度优选为2-8％(w/v)，更优选为4-6％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述葡萄糖在制剂中的浓度为2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)，最优选4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)。
8、在一些具体实施方案中，所述蔗糖在制剂中的浓度为1-8％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述蔗糖在制剂中的浓度优选为1-5％(w/v)，更优选为1-2％(w/v)。在一些具体实施方案中，所述蔗糖在制剂中的浓度为1.0％(w/v)、1.5％(w/v)、2.0％(w/v)、2.5％(w/v)、3.0％(w/v)、3.5％(w/v)、4.0％(w/v)、4.5％(w/v)、5.0％(w/v)，最优选1.0％(w/v)、1.5％(w/v)、2.0％(w/v)。
9、表面活性剂
10、根据本申请所述重组慢病毒载体制剂，其中所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
11、在一些具体实施方案中，所述泊洛沙姆188在制剂中的浓度为0.001-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组慢病毒载体制剂，其特征在于，所述制剂包括：
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述葡萄糖和蔗糖在制剂中的总浓度为1-15％(w/v)，优选3-13％(w/v)，更优选5-8％(w/v)。
3.根据权利要求1或2所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述葡萄糖在制剂中的浓度为1-10％(w/v)，优选2-8％(w/v)，更优选4-6％(w/v)。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述蔗糖在制剂中的浓度为1-8％(w/v)，优选1-5％(w/v)，更优选1-2％(w/v)。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
6.根据权利要求5所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述泊洛沙姆188在制剂中的浓度为0.001-0.5％(w/v)，优选0.001％-0.1％，更优选0.005-0.015％。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述组氨酸盐酸盐缓冲液摩尔浓度范围为1-50mmo1
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述制剂的pH值范围为6.0-8.0，优选6.5-7.4。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体为水泡性口炎病毒G蛋白包被的慢病毒载体。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体为重组人免疫缺陷病毒载体、重组猴免疫缺陷病毒载体、重组马感染性贫血病毒载体、重组猫科免疫缺陷型病毒载体或重组羊关节炎脑炎病毒载体。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体携带：(1)靶向HIV的嵌合抗原受体(CAR)的编码序列，和/或(2)靶向HIV基因的shRNA的编码序列。
15.根据权利要求14所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述CAR包含胞外区、跨膜区及胞内区，其中所述胞外区可特异性结合HIV的gp120蛋白；优选地，其中所述胞外区包含人CD4分子的D1和D2结构域。
16.根据权利要求15所述的重组慢病毒制剂，其中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ IDNO：24-29任一项所示。
17.根据权利要求16所述的重组慢病毒制剂，其中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ IDNO：25所示。
18.根据权利要求14-17任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述shRNA包括靶向gag的shRNA和靶向LTR的shRNA。
19.根据权利要求18所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述靶向gag的shRNA的序列如SEQ ID NO：1所示，靶向LTR的shRNA的序列如SEQ ID NO：2所示序列。
20.根据权利要求19所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述靶向gag的shRNA的编码序列如SEQ ID NO：3所示，靶向LTR的shRNA的编码序列如SEQ ID NO：4所示。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体的活性滴度为1×105-5×1010Tu/m1，优选5×105-5×109Tu/m1，更优选5×105-5×108Tu/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒载体制剂，其特征在于，所述制剂包括：
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述葡萄糖和蔗糖在制剂中的总浓度为1-15％(w/v)，优选3-13％(w/v)，更优选5-8％(w/v)。
3.根据权利要求1或2所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述葡萄糖在制剂中的浓度为1-10％(w/v)，优选2-8％(w/v)，更优选4-6％(w/v)。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述蔗糖在制剂中的浓度为1-8％(w/v)，优选1-5％(w/v)，更优选1-2％(w/v)。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
6.根据权利要求5所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述泊洛沙姆188在制剂中的浓度为0.001-0.5％(w/v)，优选0.001％-0.1％，更优选0.005-0.015％。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述组氨酸盐酸盐缓冲液摩尔浓度范围为1-50mmo1/l，优选5-30mmo1/l，更优选5-20mmo1/l。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述制剂的ph值范围为6.0-8.0，优选6.5-7.4。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体制剂包括：
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的重组慢病毒载体制剂，其中，所述重组慢病毒载体为水泡性口炎病毒g蛋白包被的慢病毒载体。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：江峰，倪丹妮，高晓慧，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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