【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于实验动物模型构建，具体涉及一种自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠动物模型的构建与应用。
技术介绍
1、滑膜肉瘤(synovial sarcoma，ss)是一种好发于儿童和青少年间叶组织来源的高度恶性软组织肿瘤(soft tissuesarcoma，sts)，是最常见的恶性软组织肿瘤之一。95％以上的滑膜肉瘤患者存在特征性染色体易位(x；18)(p11.2；q11.2)，即18号染色体上的ss18基因和x染色体上的ssx1、ssx2和ssx4形成融合基因。该疾病具有极高的局部复发率和远处转移率，虽然滑膜肉瘤的治疗方案包括手术治疗、放疗、化疗和靶向药物治疗等，但文献报道其转移率可高达50％，5年无转移生存率为40％-70％，在复发和转移患者中5年生存率低于20％，且在近年间无显著改善。近年研究发现，ss18-ssx基因融合产物是导致滑膜肉瘤发生发展的重要原因，但近几十年来针对病因的研究却一直未能取得有效成果。分析原因，与缺乏行之有效的模型来对ss18-ssx融合产物开展全面的机制研究不无关系。
2、crispr(clustered,regμlarlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒dna或其他外源dna的免疫机制。在细菌中，crispr系统共分成3类，其中i类和iii类需要多种crispr相关蛋白(cas蛋白)的参与而共同发挥作用，而ii类系统只需要一种cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自streptococcus py
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是：如何构建一种自发可传代滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型。
2、为解决上述技术问题，第一个方面本专利技术提供一种构建滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型的方法，所述方法包括向小鼠中导入dna分子，得到含有所述dna分子的转基因目的小鼠，将所述转基因目的小鼠传代，得到滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型；
3、所述dna分子含有syt-ssx2蛋白的编码基因，所述syt-ssx2蛋白为氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质。
4、进一步地，所述的方法中，所述dna分子还包括荧光蛋白的编码基因。
5、进一步地，所述的方法中，所述荧光蛋白为氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质。
6、进一步地，所述的方法中，所述dna分子的核苷酸序列是seq id no.3第2268-5728位。
7、在本专利技术的一个实施例中，所述dna分子的上游含有cre-lox重组系统，所述cre-lox重组系统的核苷酸序列是seq id no.3第1370-2258位。其中seq id no.3第1370-1403位为loxp，第1564-1698位、1818-1952位、第2072-2206位分别为polya signal基因，第2225-2258位为loxp。
8、进一步地，所述的方法中，所述滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型中，所述编码基因的整合位点位于受体小鼠的rosa26基因(rosa26基因位点)。
9、进一步地，所述的方法中，所述蛋白质的整合位点位于小鼠rosa26基因的第一内含子(intron 1)。
10、进一步地，所述方法包括s1)和s2)
11、s1)、将cas9蛋白质、靶向rosa26基因的sgrna和含有权利要求1-3中所述的dna分子的重组载体注射到小鼠原核期受精卵中获得基因重组的受精卵细胞；
12、s2)、将s1)获得的基因重组的受精卵细胞移植到雌性受体小鼠的输卵管内，使所述基因重组的受精卵细胞在所述受体小鼠的子宫中发育，筛选鼠仔获得转基因目的小鼠。
13、进一步地，所述的方法中，所述方法还包括s3)或/和s4)
14、s3)、将s2)获得的转基因目的小鼠与野生型小鼠杂交，筛选获得转基因杂合体子代小鼠；
15、s4)、将s3)获得的杂合体子代小鼠中的雄性鼠和雌性鼠进行交配，筛选获得转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠；
16、s5)、将s4)获得的转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠与携带cre限制性内切酶的小鼠进行交配，筛选获得自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠，或
17、在s4)获得的转基因杂合体或转基因纯合体子代小鼠的纤维结缔及肌肉组织内注射携带cre重组酶(如腺病毒载体cre，adeno-cre等)后获得自发性条件性滑膜肉瘤转基因小鼠。
18、进一步地，上述的方法中，s2)转基因目的小鼠的筛选方法包括如下步骤：
19、c1)、使用引物r26 gtf和r26 gtr以待测样本的cdna为模板进行pcr反应；
20、c2)、使用引物r26 gtf和t-pa sr-y以待测样本的cdna为模板进行pcr反应实验；
21、c3)、结果判断：c1)步骤扩增出215bp的目的条带且c2)步骤扩增出307bp的目的条带，则待测样本为转基因目的小鼠(转基因杂合体小鼠)；
22、其中上述各引物的核苷酸序列分别如下：
23、r26 gtf：5’-gagttctctgctgcctcctg-3’(seq id no.5)；
24、r26gtr：5’-ccgaaaatctgtgggaagtc-3’(seq id no.6)；
25、t-pa sr-y：5’-tgcaagcttctgatggaatt-3’(seq id no.7)。
26、进一步地，上述的方法中，s3)所述转基因杂合体子代小鼠和s4)所述转基因纯合体子代小鼠的筛选方法包括如下步骤：
27、d1)、pcr1实验：使用引物r26 gtf和r26 gtr以待测小鼠的cdna为模板进行pcr反应；
28、d2)、pcr2实验：使用引物r26 gtf和t-pa sr-y以待测小鼠的cdna为模板进行pcr反应实验；
29、d3)、结果判断：①d1)步骤中无条带扩增且d2)步骤扩增出307bp的目的条带，则待测样本为s4)所述转基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型的方法，所述方法包括向小鼠中导入DNA分子，得到含有所述DNA分子的转基因目的小鼠，将所述转基因目的小鼠传代，得到滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA分子还包括荧光蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光蛋白为氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.3第2268-5728位。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型中，所述编码基因的整合位点位于受体小鼠的Rosa26基因。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法包括S1)和S2)，
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括S3)或/和S4)
8.根据权利要求6或7中所述的方法，其特征在于：S2)或S4)所述筛选的方法包括：p>
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于：S1)所述sgRNA的靶标序列为SEQ ID No.4第1-20位。
10.权利要求1-9中任一项所述的DNA分子或/和与所述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料包括：
...【技术特征摘要】
1.一种构建滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型的方法，所述方法包括向小鼠中导入dna分子，得到含有所述dna分子的转基因目的小鼠，将所述转基因目的小鼠传代，得到滑膜肉瘤转基因小鼠动物实验模型；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述dna分子还包括荧光蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光蛋白为氨基酸序列是seq idno.2的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述dna分子的核苷酸序列是seq id no.3第2268-5728位。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述滑膜肉瘤转...
【专利技术属性】
技术研发人员：王冀川，张然昕，赵志庆，任婷婷，汤小东，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：
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