【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，涉及一种用于提高体外无细胞蛋白合成活性的基因工程菌株及其在d2p中应用及其制备方法和在d2p中应用。
技术介绍
1、无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,cfps)是一种以外源mrna或dna为模板，在体外条件下的使用酶、氨基酸底物和能量来合成蛋白质的技术。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如能够直接以pcr产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，可开展高通量多肽或蛋白质类药物筛选，此外，体外无细胞合成系统在表达对细胞有毒害作用的多肽或蛋白质的应用方面也具有独特优势。无细胞蛋白质表达系统是基于细胞的蛋白质表达系统的重要补充。
2、现有的无细胞蛋白质合成体系主要可以分为两类：其一是将获得的纯化的蛋白质合成所需的核糖体、酶、trna等按一定的比例进行组合复配，使其获得体外表达蛋白质的能力，即纯化的无细胞蛋白质表达系统(pure)。该系统具有清晰的组分信息，可以方便地、定制化地对配方进行调整以获得不同的蛋白质表达特性，但缺点是制备工艺流程复杂且成本高昂；另一类则是从具有蛋白质表达活性的活体细胞的提取物中获得主要活性物质，并适当添加所需的酶、底物、能量物质及其他组分，使其获得体外表达蛋白质的能力，即基于细胞提取物的无细胞蛋白质表达体系。相比于pure系统，后者具有操作流程简单、周期短、成本低等优点，但是后者也有系统内组分复杂、不可控因素多等缺点，因此对细胞提取物的来源细胞特性有更高的要求。但是，目前该系统的配套技术流程及背景菌株仍存在巨大
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于是通过遗传改造提高基于乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)细胞提取物的无细胞蛋白质表达(dna to protein,d2p)体系的蛋白质表达水平。
2、本专利技术第一方面提供一种用于体外无细胞蛋白合成的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株内源的蛋白酶基因被改造，并且，在所述基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性被降低；
3、优选地，所述的蛋白酶基因选自：ape1、ape3、ape4、atg4、cps1-1、cps1-2、cps1-3、cps1-4、pep4、prb1、prc1中的一种或多种。
4、所述基因工程菌株为来源于选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母；优选地为克鲁维酵母，更优选地为乳酸克鲁维酵母。其中一些优选例中，所述克鲁维酵母为一种或多种类型基因工程改造过的乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis，k.lactis)，所述基因工程改造用于提高其体外蛋白表达活性，这样基因工程改造选自：exn53基因(核酸酶基因)敲除、高效外源基因表达盒的构建等或k.lactis y1140菌株。
5、所述的蛋白酶基因来源于酿酒酵母、毕氏酵母和/或克鲁维酵母。
6、所述的ape1的编码基因如seq id no:1所示；
7、所述的ape3的编码基因如seq id no:2所示；
8、所述的ape4的编码基因如seq id no:3所示；
9、所述的atg4的编码基因如seq id no:4所示；
10、所述的cps1-1的编码基因如seq id no:5所示；
11、所述的cps1-2的编码基因如seq id no:6所示；
12、所述的cps1-3的编码基因如seq id no:7所示；
13、所述的cps1-4的编码基因如seq id no:8所示；
14、所述的pep4的编码基因如seq id no:9所示；
15、所述的prb1的编码基因如seq id no:10所示；
16、所述的prc1的编码基因如seq id no:11所示。
17、在一优选地的实施方案中所述的蛋白酶基因选自ape4、ape3、atg4、cps1-4、atg4中的一种或多种。
18、在本专利技术中，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性被降低满足以下条件：
19、b1/b0的比值≤30％；其中，b1为改造后基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性；b0为改造前蛋白酶基因的表达或活性；优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤10％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤5％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤2％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值选自0-2％。
20、在另一优选例中，所述菌株中的蛋白酶基因的表达或活性被降低通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、rna干扰技术、crispr技术、或其组合。
21、本专利技术第二方面本专利技术提供一种制备本专利技术第一方面所述的用于体外无细胞蛋白合成的基因工程菌株的方法，包括下述步骤：
22、(1)1.grna靶向序列的设计
23、选取靶向蛋白酶基因的orf区域，在crispor(tefor.net)
24、(http://crispor.tefor.net/)网站上进行grna的设计，并选取评分较高的grna作为备选序列，根据备选的grna靶向序列，合成对应的引物对；
25、(2)grna_cas9表达载体的构建
26、将步骤(1)获得引物对分别稀释并加入pcr管中混合后在pcr仪上完成退火操作，将经bsai酶切处理并纯化的pcasmfr载体，在t4连接酶体系中混合，加入退火后的引物进行连接反应；连接产物全部转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，并在含卡那霉素的lb平板上进行筛选，选择测序正确的克隆提取grna_cas9共表达质粒并测定浓度后用于后续电转化实验；
27、(3)双链dna donor的构建
28、dna donor序列通过overlap-pcr方法获得。在选取的蛋白酶基因的orf外选取4个引物p1、p2、p3和p4，分别以p1+p2及p3+p4为正反向引物对，以k.lactis y1140的基因组dna为模板，采用phanta super fidelity dnapolymerase进行pcr扩增得到pcr产物h1和h2；并以p1+p4，以上一步pcr的产物h1和h2为模板进行第二轮pcr，即获得双链dna donor产物，产物经70％乙醇沉淀后溶解在d2o中冻存-20℃以下保存备用；
29、(4)酵母菌株的转化及筛选
30、通过电转化方法完成对酵母菌株的转化，电击前将40μl感受态细胞混合物与步骤(2)制备的grna_cas9表达质粒和步骤(3)制备的dna donor充分混合，按规范操作流程完成电转化过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于提高体外无细胞蛋白合成活性的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株内源的蛋白酶基因被改造，并且，在所述基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性相比改造前被降低；
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性被降低满足以下条件：B1/B0的比值≤30％；其中，B1为基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性；B0为所述改造前的蛋白酶基因的表达或活性；优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：B1/B0的比值≤10％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：B1/B0的比值≤5％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：B1/B0的比值≤2％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：B1/B0的比值选自0-2％。
3.如权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，述基因工程菌株为来源于选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母；优选地为克鲁维酵母，更优选地为乳酸克鲁
4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述克鲁维酵母为一种或多种类型基因工程改造过的乳酸克鲁维酵母，所述基因工程改造用于提高其体外蛋白表达活性。
5.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的蛋白酶基因选自ape4、ape3、atg4、cps1-4以及atg4中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述蛋白酶基因具有如下序列：
7.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述菌株中的蛋白酶基因的表达或活性被降低通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的基因工程菌株在提高体外蛋白合成效率中的应用。
9.一种体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于，所其特征在于，所述体外无细胞蛋白合成体系包含由如权利要求1-7任一项所述的基因工程菌株制备细胞提取物。
10.如权利要求9所述的合成体系，其特征在于，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：(b)聚乙二醇；(c)任选的外源蔗糖；和(d)任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂；
11.一种体外无细胞合成蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供权利要求9-10任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系，并加入外源的用于指导蛋白质合成的DNA分子；(ii)在适合的条件下，孵育步骤(i)的体外无细胞蛋白合成体系一段时间T1，从而合成由所述外源DNA编码的蛋白质；优选地，所述体外合成蛋白的方法还包括：(iii)任选地从所述体外无细胞蛋白合成体系中，分离或检测所述的由外源DNA编码的蛋白质；优选地，所述步骤(ii)中，反应温度为20-37℃，较佳地，20-25℃；进一步优选地，所述步骤(ii)中，反应时间为1-72h，较佳地，2-23h。
...【技术特征摘要】
1.一种用于提高体外无细胞蛋白合成活性的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株内源的蛋白酶基因被改造，并且，在所述基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性相比改造前被降低；
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性被降低满足以下条件：b1/b0的比值≤30％；其中，b1为基因工程菌株中蛋白酶基因的表达或活性；b0为所述改造前的蛋白酶基因的表达或活性；优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤10％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤5％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值≤2％；更优选地，所述“降低”是指将所述蛋白酶基因的表达或活性降低满足以下条件：b1/b0的比值选自0-2％。
3.如权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，述基因工程菌株为来源于选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母；优选地为克鲁维酵母，更优选地为乳酸克鲁维酵母。
4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述克鲁维酵母为一种或多种类型基因工程改造过的乳酸克鲁维酵母，所述基因工程改造用于提高其体外蛋白表达活性。
5.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的蛋白酶基因选自ape4、ape3、atg4、cps1-4以及atg4中的一种或多...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，熊亮，曹欣茹，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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