【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病毒检测的，涉及tmv检测，尤其涉及基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用。
技术介绍
1、烟草作为我国的重要经济作物之一，具有种植面积大、分布广以及收益高的特点。烟草病毒病是我国烟草生产上分布最广、发生最为普遍、危害程度最大的一大类病害，田间病株发病率一般在20%-40%，最高可达到40%-80%，我国已发现的烟草病毒病有16种，其中烟草普通花叶病（tmv）、黄瓜花叶病（cmv）、马铃薯y病毒（pvy）发病率最高。烟草一旦感染病毒后，细胞内的叶绿素被破坏，叶片无法进行光合作用、生长受到抑制，严重影响烟叶的产、质量，造成烟叶减产、经济效益受挫。迄今为止，尚无有效的化学防治措施，染病烟株的有效治疗试剂更为稀缺。因此，急需建立一种灵敏度强、准确度高的烟草病毒病检测方法。
2、目前对烟草病毒病的检测主要包括免疫学方法和分子生物学方法。免疫学方法中的酶联免疫吸附测定法（elisa）在烟草病毒检测上应用较广泛，但存在耗时长、干扰因素多、易出现假阳性等缺点；分子生物学方法中的反转录 pcr 反应（rt-pcr）因其灵敏度高等特点经常被应用于烟草病毒检测中；而荧光定量 pcr（qrt-pcr）方法具有灵敏度高、特异性强、可对样品实时快速定量检测等优点，已被运用于多种植物病毒的有效检测中。专利cn201410118999.x中公开了一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点；专利cn202310853578.0公开了一种可视化检测烟草花叶病的试剂盒，具有较高的准确
3、荧光光谱法是指利用某些物质被紫外光照射获得能量处于激发态，激发态分子经历碰撞及去激发过程重新发射出来具有该物质特性的荧光。荧光分析具有灵敏度高、选择性强、试样量少、分辨率高、操作简单等特点。多数荧光光谱法对检测目标物都是单一的荧光信号输出，易受温度、ph、离子浓度等干扰，而比率型荧光可解决单一信号输出所面临的问题，比率型荧光光谱法通过计算两个发射光谱的荧光强度比值作为输出信号实现对待测样品的定量分析，可以消除背景信号干扰。专利cn201811527437.5中公开了一种利用带标记的核酸适配体和核酸四链体染料构建的荧光比例探针，所述核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素a，降低传统方法检测一次荧光信号带来的实验误差，过程可控，操作简单，并且灵敏度高。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一方面本专利技术提出一种基于pcr的比率型荧光体系，包括正向引物f、反向引物r-tamra、核酸染料sg工作液，2×taq plus master mix和pbs缓冲液。
4、优选的，上述正向引物f的核苷酸序列如seq id no. 1所示；反向引物r-tamra的核苷酸序列如seq id no. 2所示，其5’端修饰有tamra基团；正向引物f和反向引物r-tamra的体积比为1:1。
5、优选的，上述pbs缓冲液浓度为10 mmol/l，ph=7.4，nacl浓度为100 mmol/l。
6、另一方面本申请的基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用，步骤如下：
7、（1）以待测样品叶片cdna为模板、以引物对f和r-tamra为引物，进行pcr，得到反应物；
8、（2）将反应物与核酸染料sg工作液混合反应，所得反应溶液经pbs缓冲液稀释后，再测定荧光信号强度，比较isg/itamra荧光强度变化，代入线性回归方程计算得待测样品中tmv的cdna浓度，实现对tmv的定量检测。
9、优选的，上述反应物与核酸染料sg工作液混合的体积比为1:3。
10、具体的，上述pcr的扩增体系为50 μl，其中正向引物f和反向引物r-tamra的体积均为2 μl、浓度为15 μmol/l，待测样品体积为5 μl，2×taq plus master mix体积为25 μl，ddh2o体积为16 μl；pcr的扩增程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35-45次；72℃ 7 min；4℃保存。
11、具体的，上述线性回归方程为isg/itamra=0.1743 lgc + 0.4928（r2=0.9965），方法检出限为0.89 amol/l。
12、进一步，上述荧光信号强度的检测参数为波长间隔△λ=25 nm，狭缝宽度5.0 nm，扫描速度600nm/min，波长扫描范围480 nm-640 nm。
13、本专利技术具有以下有益效果：
14、1.本专利技术根据genebank报道的烟草花叶病毒外壳蛋白基因设计特异性引物，并利用荧光染料四甲基罗丹明（tamra）标记的引物及核酸染料sg构建基于pcr的比率型荧光法用于tmv早期检测。
15、2.本专利技术的基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用具有以下优点：
16、①本申请通过提取黄瓜花叶病、马铃薯y病毒和芜菁花叶病毒患病烟叶cdna加入到反应液中扩增作为对照组，保持其他条件一致，三种样品所对应的体系isg/itamra与空白组一致、均无明显变化，表明此方法对tmv患病烟叶具有极高的选择性。
17、②本申请通过提取盆栽培养的健康、轻微患病和严重患病烟叶的cdna检测isg/itamra比值变化，结果表明健康烟叶sg信号值非常低，严重患病烟叶sg强度最强，轻微患病烟叶次之；从河南农业大学许昌科教园区选取一块地块进行随机取样，利用本体系方法与金标准方法分别对烟叶样品进行测定，对比可知两种试验结果一致。因此，本方法检测tmv具有准确性高的优点。
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1.一种基于PCR的比率型荧光体系，其特征在于：包括正向引物F、反向引物R-TAMRA，核酸染料SG工作液，2×Taq Plus Master Mix和PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的基于PCR的比率型荧光体系，其特征在于：所述的正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；反向引物R-TAMRA的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，其5’端修饰有TAMRA基团；其中正向引物F和反向引物R-TAMRA的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的基于PCR的比率型荧光体系，其特征在于：所述PBS缓冲液浓度为10 mmol/L，pH=7.4，NaCl浓度为100 mmol/L。
4.权利要求1-3任一项所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于，步骤如下：
6.根据权利要求5所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于：所述反应物与核酸染料SG工作液混合的体积比为1:3。>
7.根据权利要求6所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于：所述PCR的扩增体系为50 μL，其中正向引物F和反向引物R-TAMRA的体积均为2 μL、浓度均为15 μmol/L，待测样品体积为5 μL，2×Taq Plus Master Mix体积为25 μL，ddH2O体积为16 μL。
8.根据权利要求7所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35-45次；72℃ 7 min；4℃保存。
9.根据权利要求8所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于：所述线性回归方程为ISG/ITAMRA=0.1743 lgc + 0.4928，线性回归系数R2=0.9965，检出限为0.89 amol/L。
10.根据权利要求9所述的基于PCR的比率型荧光体系在TMV早期检测中的应用，其特征在于：所述荧光信号强度的检测参数为波长间隔△λ=25 nm，狭缝宽度5.0 nm，扫描速度600nm/min，波长扫描范围480 nm-640 nm。
...【技术特征摘要】
1.一种基于pcr的比率型荧光体系，其特征在于：包括正向引物f、反向引物r-tamra，核酸染料sg工作液，2×taq plus master mix和pbs缓冲液。
2.根据权利要求1所述的基于pcr的比率型荧光体系，其特征在于：所述的正向引物f的核苷酸序列如seq id no. 1所示；反向引物r-tamra的核苷酸序列如seq id no. 2所示，其5’端修饰有tamra基团；其中正向引物f和反向引物r-tamra的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的基于pcr的比率型荧光体系，其特征在于：所述pbs缓冲液浓度为10 mmol/l，ph=7.4，nacl浓度为100 mmol/l。
4.权利要求1-3任一项所述的基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用，其特征在于，步骤如下：
6.根据权利要求5所述的基于pcr的比率型荧光体系在tmv早期检测中的应用，其特征在于：所述反应物与核酸染料sg工作液混合的体积比为1:3。
7.根据权利要求6所述的基于pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红，王闯，王凡予，王磊，刘天，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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