【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞治疗领域，尤其涉及syn-car-t细胞的制备方法及其细胞和应用。
技术介绍
1、car-t细胞疗法是将特异性抗原嵌合受体car的编码基因转入t细胞，然后再将细胞重新输入患者体内，通过t细胞表达的car识别肿瘤细胞表面的靶向抗原，激活t细胞杀伤活性，进而释放穿孔素、颗粒酶、细胞因子等发挥肿瘤杀伤作用的疗法。car-t细胞会直接发挥抗肿瘤杀伤作用，无需主要组织相容性复合体(mhc)识别限制。
2、car-t细胞疗法副作用包括细胞因子释放综合征，血细胞减少，神经毒性综合征，移植物抗宿主病(gvhd)，“on target off tumor”毒性等等，其中“on target off tumor”毒性与car-t细胞单一的机械的杀伤识别模式有关。
3、roybal等在2016年新开发一种synnotch系统，是一种“and gate”回路系统，并成功应用到car-t细胞治疗中。synnotch系统作用方式：肿瘤细胞表面需同时表达相应的2种抗原，才能激活synnotch car-t(syn-car-t)细胞特异杀伤功能。因此，syn-car-t细胞可以实现智能型识别杀伤肿瘤这一目标，从而提高car-t细胞治疗的安全性。synnotch系统只改造替换了野生型notch受体的胞外区，胞内区，下游效应元件，保留notch受体的核心调控区。胞外区(输入识别信号)可用靶向各种肿瘤细胞的同源特异性抗体的scfv分子替换(如cd19-scfv)，下游效应元件(输出转录信号)可用抗体scfv分子、细胞因子、免
4、synnotch是一种合成的notch受体，将鼠的notch1受体改造，胞外域用单链抗体替换(a抗体scfv(单链抗体))，胞内域用转录激活结构域gal4vp64替换，仅保留可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心域(nc)。notch受体蛋白由胞外区片段(necd)，跨膜区片段(tmd)，胞内区片段(nicd)构成。当胞外区的受体与配体结合后，改变构象，暴露酶切位点，被金属蛋白酶和γ-分泌酶作用识别，进行切割，裂解后释放胞内区nicd，nicd可以通过核定位信号nsl易位到细胞核中并发挥转录因子的作用，从而激活下游信号通路。
5、synnotch系统的响应程序代表了一种重构t细胞响应的策略，以synnotch car-t细胞为例，肿瘤细胞表面需同时表达相应的2种抗原，才能激活car-t细胞特异杀伤功能。因此，synnotch car-t细胞可以实现精确识别杀伤肿瘤这一目标。但是，synnotch系统较大，系统控制元件包括notch受体核心区，胞内转录因子gal4vp64，uas识别序列，内部启动子，一共2.5kb左右，系统可编辑区的输入信号分子(如cd19-scfv)和输出信号分子(如bcma-car)一共2.5kb左右，整个系统占据5kb左右，需通过2个慢病毒载体质粒传递，即一个gal4诱导载体和一个uas效应载体。所以转导靶细胞时不仅需要制备二种慢病毒载体，还需要进行双病毒转导靶细胞。
6、synnotch系统还面临一个问题，uas效应载体未激活时不表达效应分子，流式无法检测转导效率，除非增加一个启动子单独表达一个荧光蛋白信号进行转导效率检测。采用慢病毒载体进行双病毒转导t细胞会产生一个制备生产问题，即制备双阳性t细胞的效率低，需要进行流式分选富集才能获得双阳率高的t细胞。此外，慢病毒载体由于vsv-g包膜蛋白毒性问题以及采用的是第三代自失活慢病毒载体进行包装，只能进行瞬时转染包装，无法大规模制备，包装滴度低，需要富集和纯化，极大限制了syn-car-t细胞治疗的临床应用。由于上述原因极大限制了synnotch系统car-t细胞治疗方面的应用，需要进一步进行受体系统优化或者载体优化。
7、通过慢病毒载体传递synnotch系统所面临的制备效率低下问题，可通过替换病毒载体进行包装来解决。目前常用的病毒载体包括γ-逆转录病毒载体(γ-rv)，γ-rv属于简单逆转录病毒，直径约为100nm，有包膜，基因组是2个拷贝的正链rna，基因组大小为8.3kb左右，基因组只包括2个ltr，gag-pol，env。γ-rv只能转导分裂期细胞，无法转导非分裂期细胞，可以整合宿主基因组，包装滴度高，插入外源目的基因大于4kb会极大降低载体包装滴度。为了进一步提高γ-rv的安全性，减少复制型rcr的产生，将γ-rv的3’ltr的u3启动子删除，改造成自失活γ-逆转录病毒载体(sin-rv)。
8、γ-rv载体具有成熟的大规模的稳定转染包装方法，生产滴度高，但是逆转录病毒载体是随机整合到宿主染色质中，有插入突变诱发宿主原癌基因表达的风险。sin-rv的u3增强子被删除，致癌风险降低，极大提高了载体的安全性。sin-rv面临的挑战是大规模生产病毒载体的困难。由于缺失u3元件，无法构建稳定转染包装细胞系，只有通过瞬时转染包装获得，难以扩大生产，而且使用传统的方法很难筛选出产生sin-rv稳定转染的细胞克隆。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供syn-car-t细胞的制备方法，所述方法包括：步骤1：利用piggybac转座子系统构建稳定转染的sin-γ-rv载体，即psr载体；步骤2：制备syncar质粒载体：用步骤1制备的所述psr载体表达synnotch系统，将所述synnotch系统的gal4诱导载体和uas效应载体合并在一个所述psr载体上，使得所述synnotch系统由一个所述psr载体进行递送，构建syn car逆转录病毒载体的质粒；和步骤3：将上述逆转录病毒载体的质粒转导t细胞，制备得到所述syn-car-t细胞。
2、piggybac转座子(pb)系统属于dna转座子，通过“剪切-粘贴”机制可将itr之间的目的基因整合到靶细胞基因组中并长期稳定表达。pb系统，pb转座子的末端是长13bp的反向重复序列(itr)，pb转座酶由单独质粒表达。pb整合机制，双质粒转染后，pb转座酶识别载体两端的itr，从itr两端切除成为游离的pb转座子(携带目的基因)，基因组ttaa位点被切开形成黏性末端，pb转座子被插入到基因组的“ttaa”位点进行整合。
3、在一种实施方式中，所述syn car逆转录病毒载体的质粒是靶向cd19分子，bcma分子，cd38分子，或gpc3分子的psr.synnotch载体的质粒。
4、在一种实施方式中，所述syn car逆转录病毒载体的质粒是靶向cd19分子的psr.synnotch载体的质粒。
5、在一种实施方式中，步骤1中，在所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Syn-CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Syn CAR逆转录病毒载体的质粒是靶向CD19分子，BCMA分子，CD38分子，或GPC3分子的PSR.SynNotch载体的质粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Syn CAR逆转录病毒载体的质粒是靶向CD19分子的PSR.SynNotch载体的质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，在所述PiggyBac转座子系统的PB转座子5’ITR和3’ITR序列之间顺序地插入SIN-γ-RV载体的5’LTR，5’UTR，和3’SIN-LTR序列；所述非编码区UTR包括为病毒载体包装信号的Ψ元件和为剪切供体位点的SD，所述3’SIN-LTR序列中U3区删除，只保留R区和U5区。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5’UTR删除所有Gag和Pol编码区序列以及起始密码子ATG。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5’LTR和3’SIN-LTR之间分别插入Syn
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在GAL4VP64蛋白下游添加P2A-EGFP荧光蛋白，作为载体受体蛋白CD19 scfv、BCMA scfv、CD38 scfv或GPC3 scfv的检测标签。
8.根据权利要求1-7任一所述方法构建的Syn-CAR-T细胞。
9.根据权利要求8所述的Syn-CAR-T细胞是靶向CD19的Syn-CAR-T细胞。
10.权利要求8所述的Syn-CAR-T细胞在制备肿瘤药物中的应用。
11.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求8所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.一种体外抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括将肿瘤细胞与如权利要求8所述的CAR-T细胞或如权利要求11所述的药物组合物接触，从而抑制所述肿瘤细胞。
...【技术特征摘要】
1.syn-car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述syn car逆转录病毒载体的质粒是靶向cd19分子，bcma分子，cd38分子，或gpc3分子的psr.synnotch载体的质粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述syn car逆转录病毒载体的质粒是靶向cd19分子的psr.synnotch载体的质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，在所述piggybac转座子系统的pb转座子5’itr和3’itr序列之间顺序地插入sin-γ-rv载体的5’ltr，5’utr，和3’sin-ltr序列；所述非编码区utr包括为病毒载体包装信号的ψ元件和为剪切供体位点的sd，所述3’sin-ltr序列中u3区删除，只保留r区和u5区。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5’utr删除所有gag和pol编码区序列以及起始密码子atg。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5’ltr和3’sin...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建勋，陈静，张野，王文娟，冯娅茹，
申请(专利权)人：广东君厚生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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