【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学诊断，尤其涉及一种基于crispr-cas13d体系检测prrsv-1的方法。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的一种高度传染性疾病，严重影响全球生猪养殖业。猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)是一种有囊膜的单股正链rna病毒，属于动脉病毒科，尼多病毒目。prrsv基因组长度约为15kb，由一个5′端和一个3′端多聚腺苷化的非翻译区(utr)和至少11个开放阅读框(open reading frame，orf)组成，包括orf1a、orf1b、orf2a、orf2b、orf5a、orf3～7、orf2tf。该病毒主要通过呼吸道传播，感染猪群后会导致严重的呼吸道疾病和生殖问题，如母猪流产、早产、死胎以及仔猪的高死亡率。prrsv根据其基因特性分为两型：prrsv-1(欧洲型)和prrsv-2(北美型)，它们在全基因组水平上核苷酸同源性只有60％。prrsv-2由于其快速的传播速度以及高致病性备受关注，且近年来，prrsv-1的致病性有上升的趋势。因此，prrsv-1的监测很有必要。
2、目前除了通过直观的临床症状进行诊断外，prrsv 1检测的方法主要包括病毒分离(vi)、间接免疫荧光法(ifa)、免疫过氧化物酶单层法(ipma)、血清病pcr(dpcr)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导等温扩增(lamp)、元基因组新一代测序(mngs)和酶联免疫
3、crispr/cas13d(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat)是一种新兴的基因编辑和诊断工具，属于crispr家族的一部分。crispr系统最初作为细菌和古细菌的适应性免疫系统被发现，能够通过rna引导的dna切割机制抵御外来遗传物质。crispr-cas系统由crispr基因座和cas基因构成，crispr基因座包括前导序列(leader)、重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)。系统中，cas基因编码了多个与crispr相关的蛋白质，如cas9、cas12a和cas13d等，共约有几十种。近年来，crispr技术迅速发展并被广泛应用于基因编辑、生物医学研究和分子诊断领域。而cas13d是crispr家族中一种新发现的效应蛋白，与更为熟知的cas9不同，cas13d针对的是rna而非dna。其特征在于高效的rna识别和切割能力，且相对较小的分子量使其在细胞内表达更加简便。此外，cas13d在切割目标rna后会激活旁侧活性(collateral activity)，导致周围的非特异性rna也被切割，这一特性被巧妙地应用于分子诊断技术中。在crispr/cas13d系统中，向导rna(guide rna,grna)会引导cas13d蛋白特异性地识别和结合目标rna分子。结合后，cas13d会激活其rnase活性，切割目标rna，同时由于旁侧活性，可切割周围的报告分子rna(通常是带有荧光标记的rna片段)，从而产生易于检测的荧光信号。这种基于crispr/cas13d的检测方法具有高度的特异性和灵敏性，可在无需复杂设备的情况下实现快速检测。与传统的分子诊断技术相比，crispr/cas13d系统能够在较短时间内提供结果，并且操作简便、成本较低，适合现场检测和大规模筛查应用。
4、prrsv-1(猪繁殖与呼吸综合征病毒1型)是全球养猪业面临的一种主要传染性疾病，目前多个国家已经报道了高致病性的prrsv-1。授权专利cn110656123b中检测的对象为prrsv-2型，并不是prrsv-1型，目前对于prrsv-1的检测主要依赖于rt-pcr以及rt-qpcr技术，该方法需要仪器支持且操作较为繁琐，检测中还可能会出现漏检的情况。
技术实现思路
1、本专利技术利用crispr/cas13d和raa技术开发了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(prrsv-1)的易于操作、高灵敏度、结果直观的检测试剂盒，实现了prrsv-1的高效、可视化检测，为现场快速诊断和疾病防控提供了一种创新的技术手段。
2、本专利技术提供了一种基于crispr-cas13d体系检测prrsv-1的crrna，所述crrna分子的序列如seq id no.9所示。
3、本专利技术还提供了一种基于crispr-cas13d体系检测prrsv-1的产品，所述产品中含有上述crrna分子。
4、优选地，所述产品为试剂或试剂盒。
5、更优选地，所述试剂盒中还含有cas13d蛋白、ssrna荧光报告探针、以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。
6、更优选地，所述ssrna荧光报告探针为5′-fam-uuuuu-bhq1-3′。
7、本专利技术还提供上述crrna分子在制备检测prrsv-1产品中的用途。
8、优选地，所述产品为试剂盒。
9、更优选地，所述试剂盒中还含有cas13d蛋白、ssrna荧光报告探针、以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。
10、更优选地，所述试剂盒的使用方法为：
11、(1)以待测样本cdna为模板扩增获得产物，体外转录获得ssrna；
12、(2)步骤(1)中获得的ssrna、cas13d蛋白、ssrna荧光报告探针、以及crrna分子在crispr-cas13d反应体系里反应；
13、(3)步骤(2)反应完毕后，将反应体系置于蓝光或紫外光下观察检测结果。
14、更优选地，所述用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物序列分别如seq id no.3和seq id no.6所示。
15、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
16、本专利技术提供了一种用于现场可视化检测猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(prrsv-1)的试剂盒，该试剂盒基于重组酶聚合酶扩增技术(raa)和crispr-cas13d技术。该方法能够有效检测临床阳性prrsv-1样本，并通过rna荧光报告分子实现现场可视化检测。检测仅需使用蓝光透射仪照射，通过观察反应体系中是否出现扩增产物即可判定检测结果。此外，该试剂盒还支持使用qpcr仪器进行定量检测，从而能够在1小时内快速获得结果。
17、该专利技术凭借其独特的优势，显著减少了诊断过程中的经济成本和时间消耗，同时摆脱了昂贵实验室设备的依赖。其关键元本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas13d体系检测PRRSV-1的crRNA，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.9所示。
2.一种基于CRISPR-Cas13d体系检测PRRSV-1的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1中所述的crRNA分子。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中还含有Cas13d蛋白、ssRNA荧光报告探针、以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssRNA荧光报告探针为5′-FAM-UUUUU-BHQ1-3′。
6.权利要求1中所述的crRNA分子在制备检测PRRSV-1产品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中还含有Cas13d蛋白、ssRNA荧光报告探针、以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。
<...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas13d体系检测prrsv-1的crrna，其特征在于，所述crrna分子的序列如seq id no.9所示。
2.一种基于crispr-cas13d体系检测prrsv-1的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1中所述的crrna分子。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中还含有cas13d蛋白、ssrna荧光报告探针、以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssrna荧光报告探针为5...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾钦瑞，王圆梦，朱玲，徐志文，葛良鹏，曾秀，孙静，梁浩，郎巧利，刘作华，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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