【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程或生物，具体涉及高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid；gaba）是一种四碳非蛋白质氨基酸，在微生物、植物和动物体内发挥多种生理功能。gaba在医药食品领域应用广泛，富含gaba的食品有助于提高睡眠质量、促进新陈代谢、恢复脑细胞活力等，临床上主要用于高血压、癫痫、心率失常、睡眠障碍、焦虑和抑郁症等疾病的治疗。在农业畜牧方面，gaba作为食品添加剂可提高动物的免疫力和食欲，提高经济效益。化学工业方面，gaba可合成2-吡咯烷酮和可生物降解材料聚酰胺尼龙4的前体。
2、目前，gaba的生产方法主要有化学合成、植物富集及生物合成。化学合成反应速度快、产量高，但存在原料毒性大、反应环境严格、设备成本高、易产生有毒有害副产物、造成环境污染等问题。相较于化学合成，通过低温或高盐胁迫处理从植物中富集gaba操作简单、安全、坏境友好，但其存在富集产率低和成本高的局限性。生物合成是利用微生物将底物转化为gaba，具有环境友好、反应温和、绿色环保的优点，又因微生物具有繁殖周期短、生长快及适应性强等特点受到广泛关注。gaba的生物合成途径主要是由吡哆醛5'-磷酸（pyridoxal-5'-phosphate；plp）依赖的谷氨酸脱羧酶（glµtamate decarboxylase，gad）催化l-glu脱羧形成γ-氨基丁酸，反应过程中消耗h+并产生co2。大多数gad只在低ph值下有活性，ph值高于6时几乎完全丧失活性，通过在不同条
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用，用以解决现有的gaba生产成本高，酶活性低以及gad最适ph值与gaba一步法生产不兼容的技术问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一个方面，公开了高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，以 e.colibl21（de3）作为宿主菌，在t7启动子的作用下异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因 gadb△c11，再在arabad启动子作用下异源表达串联弱rbs的基因 gadc△c41和串联强rbs的基因 pdxy，得到高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌；
4、其中，弱rbs的核苷酸序列如seq id no.14所示，强rbs的核苷酸序列如seq idno.27所示。
5、优选地，突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因 gadb△c11来源于植物乳植杆菌。
6、优选地，基因 gadc△c41来源于 e.colidh5α。
7、优选地，基因 pdxy来源于 e.colidh5α。
8、优选地，异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因 gadb△c11用到的表达载体为pet28a。
9、优选地，异源表达基因 gadc△c41和基因 pdxy用到的表达载体为pbad18。
10、本专利技术的第二个方面，公开了上述构建方法得到的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌。
11、本专利技术的第三个方面，公开了上述高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
12、本专利技术的第四个方面，公开了一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，将上述高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素和氨苄霉素的lb液体培养基中培养至od600＝0.6，同时加入iptg、l-阿拉伯糖和维生素b6诱导，收集菌体；在菌体中加入底物转化，得到γ-氨基丁酸；
13、其中，每升含卡那霉素和氨苄霉素的lb液体培养基包括：10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、10 g nacl、10 mm维生素b6、0.1 g卡那霉素和0.1 g氨苄霉素，余量为水。
14、优选地，iptg的终浓度为0.5 mm。
15、优选地，l-阿拉伯糖的终浓度为20~100 µm。
16、优选地，维生素b6的终浓度为10 mm。
17、优选地，在16℃，200 rpm诱导16 h。
18、优选地，转化时，菌体浓度为5~20 od600。
19、优选地，底物为l-谷氨酸或l-谷氨酸钠。
20、优选地，底物的浓度为600~1200 mg/ml。
21、优选地，转化1~8 h。
22、优选地，将上述构建方法得到的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素和氨苄霉素的lb液体培养基中培养至od600＝0.6，加入终浓度为0.5 mm的iptg、终浓度为60 µm的l-阿拉伯糖和终浓度为10 mm的维生素b6诱导，收集菌体；在浓度为15 od600的菌体中加入浓度为1200 mg/ml的l-谷氨酸转化7 h，得到γ-氨基丁酸。
23、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
24、本专利技术提供的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌，以大肠杆菌bl21（de3）（简称 e.colibl21（de3））作为宿主菌，利用 e.colibl21（de3）整合有噬菌体t7 rna聚合酶基因的特性，将 e.colibl21（de3）与含有强诱导型启动子t7的表达载体pet28a联用来异源表达调控植物乳酸杆菌来源的突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因（glutamate decarboxylase b， gadb△c11），将重组大肠杆菌对ph的响应范围扩大至中性。通过使用弱诱导型阿拉伯糖启动子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，以E.coli BL21（DE3）作为宿主菌，在T7启动子的作用下异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB△C11，再在araBAD启动子作用下异源表达串联弱RBS的基因gadC△C41和串联强RBS的基因pdxY，得到高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌；
2.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB△C11来源于植物乳植杆菌。
3.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，基因gadC△C41来源于E.coli DH5α。
4.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，基因pdxY来源于E.coli DH5α。
5.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因gadB△C11用到的表达载体为pET28a。
6.根据权利要求1所述的高效生产γ-
7.权利要求1~6任意一项所述的构建方法得到的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌。
8.权利要求7所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
9.一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，将权利要求7所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素和氨苄霉素的LB液体培养基中培养至OD600＝0.6，同时加入IPTG、l-阿拉伯糖和维生素B6诱导，收集菌体；在菌体中加入底物转化，得到γ-氨基丁酸；
10.根据权利要求9所述的一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，IPTG的终浓度为0.5 mM，l-阿拉伯糖的终浓度为20~100 µM，维生素B6的终浓度为10 mM。
...【技术特征摘要】
1.高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，以e.coli bl21（de3）作为宿主菌，在t7启动子的作用下异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因gadb△c11，再在arabad启动子作用下异源表达串联弱rbs的基因gadc△c41和串联强rbs的基因pdxy，得到高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌；
2.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，突变型谷氨酸脱羧酶的编码基因gadb△c11来源于植物乳植杆菌。
3.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，基因gadc△c41来源于e.coli dh5α。
4.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，基因pdxy来源于e.coli dh5α。
5.根据权利要求1所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，异源表达突变型谷氨酸脱羧酶的编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘江花，贾世杰，李国梁，王雨，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：
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