【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疾病诊断领域，具体涉及基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，还涉及该试剂盒的应用。
技术介绍
1、p53基因是人类癌症发展的主要参与者，主要通过激活衰老、细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬等途径发挥抗癌作用，并被认为是最重要的肿瘤抑制基因。突变的p53基因有利于细胞的存活和增殖，从而促进癌症的发生。研究表明，在大约50％的癌症中存在p53基因突变。因此，非侵入性的检测p53基因对于癌症的早期筛查和诊断至关重要。目前，用于p53基因检测的方法主要包括实时定量聚合酶链反应(qpcr)和下一代测序(ngs)等。然而，这些方法存在操作繁琐、检测成本高、依赖昂贵精密的热循环仪等缺点，限制了它们在资源贫乏地区的广泛应用。相比之下，crispr/cas分子诊断系统兼备高灵敏及高特异性的独特优势，近年来逐步发展为下一代诊断技术的核心，因为它具有操作简单、低成本、便携性等优点。因此，亟需构建一种简单、低成本、灵敏度高且特异性强的p53基因检测方法，以广泛用于癌症患者的早期筛查及诊断。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒；本专利技术的目的之二在于提供基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒在检测p53基因中的应用；本专利技术的目的之三在于提供利用所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，所述试剂盒包括切刻酶触发靶核酸循环体系，切刻酶诱导指数rca扩增体系和crispr/cas12a反应体系；
4、所述切刻酶触发靶核酸循环体系含有环状单链dna1和nt.bstnbi酶，环状单链dna1含有与p53基因互补序列，并在互补双链区形成nt.bstnbi酶作用位点，当存在p53基因时，环状单链dna1与p53基因杂交形成双链，因而被nt.bstnbi酶剪切为线性dna1片段，并释放p53基因；
5、所述切刻酶诱导指数rca扩增体系含有环状单链dna2和nt.bbvci酶和phi29 dna聚合酶；所述环状单链dna2含与环状单链dna1碱基互补配对区域和nt.bbvci酶识别位点，所述环状单链dna2能够作为模板，使线性dna1片段在phi29 dna聚合酶存在下沿环状单链dna2进行扩增延伸；并在nt.bbvci酶作用下剪切线性dna1片段沿环状单链dna2扩增的产物，并将产物从环状单链dna2上释放，作为新引物触发下一个rca反应；
6、所述crispr/cas12a反应体系包括crrna序列，荧光信号探针，所述crrna序列能够与cas12a蛋白结合形成复合体crrna/cas12a并与rca产物杂交，所述crrna/cas12a复合体在rca产物存在下反式切割活性被激活，所述激活的crrna/cas12a复合体能够切割荧光信号探针，释放荧光信号。
7、本专利技术优选的，所述环状单链dna1的序列如sqe id no.2所示，所述环状单链dna2序列如seq id no.3所示，所述crrna序列如seq id no.4所示，所述荧光信号探针如5’-fam-ttatt-bhq-3’所示。
8、本专利技术优选的，所述环状单链dna1的浓度为10nm～1μm；所述nt.bstnbi酶浓度为1～10u；所述环状单链dna2的浓度为1nm～10nm；所述phi29 dna聚合酶浓度为1～10u；所述nt.bbvci酶浓度为1～10u；所述cas12a酶浓度为0.1～2μm；所述crrna浓度为0.1～2μm；所述荧光信号探针浓度为1～10μm。
9、本专利技术优选的，所述切刻酶触发靶核酸循环体系，包括1μm环状单链dna1，3unt.bstnbi酶和反应缓冲液1；所述反应缓冲液1包括100mm nacl，50mm tris-hcl，10mmmgcl2，100μg/ml重组白蛋白。
10、本专利技术优选的，切刻酶诱导指数rca扩增体系包括10nm环状单链dna2，2unt.bbvci酶，2u phi29 dna聚合酶，10mm dntps，1mm dtt，1×phi29 dna聚合酶反应缓冲液。
11、本专利技术优选的，所述crispr/cas12a反应体系包括1μm crrna，1.5μm cas12a酶，1μm荧光信号探针以及反应缓冲液2；所述反应缓冲液包含50mm nacl、10mm tris-hcl、10mmmgcl2、100μg/ml重组白蛋白。
12、2、所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒在检测p53基因中的应用。
13、3、利用所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒检测p53基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
14、(1)将待测样本加入含1μm环状单链dna1、3u nt.bstnbi酶和反应缓冲液1的混合溶液中；充分混匀后，55℃下孵育1小时，使nt.bstnbi酶能够将环状单链dna1充分剪切为线性dna1片段，随后加热至95℃保持5分钟，以灭活nt.bstnbi酶；
15、(2)将步骤(1)获得产物加入含10nm环状单链dna2、2u nt.bbvci酶、2u phi29dna聚合酶、10mm dntps、1mm dtt、1×phi29 dna聚合酶反应缓冲液的混合溶液中，充分混匀后，37℃下孵育1小时，使线性dna1沿环状单链dna2模板不断延伸，且延伸的产物能够被nt.bbvci酶剪切，被切割下来的短片段产物能够从环状单链dna2上释放下来，并作为引物诱导下一个rca反应，实现指数rca扩增，最后加热至80℃保持20分钟，以灭活nt.bstnbi酶和phi29 dna聚合酶；
16、(3)向洁净无酶的pcr反应管中加入1μm crrna、1.5μm cas12a酶以及应缓冲液2，室温放置10分钟，以形成crrna/cas12a复合物；
17、(4)将步骤(2)获得的切刻酶诱导指数rca扩增产物以及1μm荧光信号探针加入步骤(3)制备的混合溶液中，充分混匀后，37℃下孵育5分钟；在rca产物存在时，cas12a酶被激活，并对其该反应体系中的荧光信号探针发生剪切作用，从而释放荧光信号；通过每间隔1分钟实时采集荧光信号值，以检测样本中p53基因含量；
18、所述缓冲液1各组分浓度如下：100mm nacl，50mm tris-hcl，10mm mgcl2，100μg/ml重组白蛋白；
19、所述缓冲液2各组分浓度如下：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括切刻酶触发靶核酸循环体系，切刻酶诱导指数RCA扩增体系和CRISPR/Cas12a反应体系；
2.根据权利要求1所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述环状单链DNA1的序列如SQE ID NO.2所示，所述环状单链DNA2序列如SEQ ID NO.3所示，所述crRNA序列如SEQ ID NO.4所示，所述荧光信号探针如5’-FAM-TTATT-BHQ-3’所示。
3.根据权利要求1所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述环状单链DNA1的浓度为10nM～1μM；所述Nt.BstNBI酶浓度为1～10U；所述环状单链DNA2的浓度为1nM～10nM；所述phi29 DNA聚合酶浓度为1～10U；所述Nt.BbvCI酶浓度为1～10U；所述Cas12a酶浓度为0.1～2μM；所述crRNA浓度为0.1～2μM；所述荧光信号探针浓度为1～
4.根据权利要求1所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述切刻酶触发靶核酸循环体系，包括1μM环状单链DNA1，3UNt.BstNBI酶和反应缓冲液1；所述反应缓冲液1包括100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml重组白蛋白。
5.根据权利要求1所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：切刻酶诱导指数RCA扩增体系包括10nM环状单链DNA2，2UNt.BbvCI酶，2Uphi29 DNA聚合酶，10mM dNTPs，1mM DTT，1×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液。
6.根据权利要求1所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a反应体系包括1μM crRNA，1.5μM Cas12a酶，1μM荧光信号探针以及反应缓冲液2；所述反应缓冲液包含50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml重组白蛋白。
7.权利要求1～6任一项所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒在检测p53基因中的应用。
8.利用权利要求1～6任一项所述基于无非特异性指数RCA激活CRISPR/Cas12a的p53基因检测试剂盒检测p53基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括切刻酶触发靶核酸循环体系，切刻酶诱导指数rca扩增体系和crispr/cas12a反应体系；
2.根据权利要求1所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述环状单链dna1的序列如sqe id no.2所示，所述环状单链dna2序列如seq id no.3所示，所述crrna序列如seq id no.4所示，所述荧光信号探针如5’-fam-ttatt-bhq-3’所示。
3.根据权利要求1所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述环状单链dna1的浓度为10nm～1μm；所述nt.bstnbi酶浓度为1～10u；所述环状单链dna2的浓度为1nm～10nm；所述phi29 dna聚合酶浓度为1～10u；所述nt.bbvci酶浓度为1～10u；所述cas12a酶浓度为0.1～2μm；所述crrna浓度为0.1～2μm；所述荧光信号探针浓度为1～10μm。
4.根据权利要求1所述基于无非特异性指数rca激活crispr/cas12a的p53基因检测试剂盒，其特征在于：所述切刻酶触发靶核酸循环体系，包括1μm环状...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯春凤，张立群，刘飞，刘畅，陈曼，李毅，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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