【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及变体rnai分子。在一些方面，本专利技术涉及用于治疗肌营养不良的变体rnai分子。
技术介绍
1、在对基因功能的基础研究中，已经证实rna干扰(rnai)是基因沉默的有用工具，并且rnai显示出作为治疗剂阻抑与许多疾病的发展相关的基因的巨大前景。在自然界中，由rnai进行的基因调控通过称为微rna(mirna)的小rna进行(ambros,(2004)nature[自然]431:350-355；krol等人,(2010)nat.rev.genet.[自然综述：遗传学]11:597-610)。微rna已经成为多种细胞过程的有力调控剂，并且当由病毒载体递送时，人工mirna被连续表达，从而导致靶基因的稳健且持续的阻抑。对mirna加工中涉及的机制的阐明已经允许科学家利用内源性细胞rnai机制并使用人工mirna来指导靶基因产物的降解(参见，例如us pg pub.[授权前公开]2014/0163214和davidson等人,(2012)cell[细胞]150:873-875)。
2、肌强直性营养不良1型(dm1)是由dmpk基因座中ctg重复序列(>50)的扩增引起的单基因、常染色体显性的进行性疾病。具有重复序列的dmpk转录成mrna，该mrna形成发夹并结合rna结合蛋白，从而使这些结合蛋白无法发挥其正常功能。这导致核灶的出现、mrna的错误剪接并且最终导致肌强直。dm1主要影响骨骼肌、心肌和平滑肌，从而引起显著的身体、认知和行为损害和残疾。目前尚无批准用于dm1的疗法。因此，对于治疗dm1的疗法
3、本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过援引以其全文并入。
技术实现思路
1、在一些方面，本专利技术提供了包含第一链和第二链的rnai，其中a)该第一链和该第二链形成双链体；b)该第一链包含指导区，其中该指导区包含具有序列5’-agucgaagacaguucuagggu-3’(seq id no:1)或具有与seq id no:1的序列具有约90％同一性的序列的核酸；并且c)第二链包含非指导区。在一些实施例中，该非指导区包含具有序列5’acccuagaugucuucgauu-3’(seq id no:2)或具有与seq id no:2的序列具有约90％同一性的序列的核酸。在一些实施例中，该第一链包含具有seq id no:1的序列的核酸，并且该非指导区包含具有seq id no:2的序列的核酸。在一些实施例中，该第一链和该第二链借助于能够形成环结构的rna接头连接。在一些实施例中，该rna接头包含约4至约50个核苷酸。在一些实施例中，该环结构包含约4至约20个核苷酸。在一些实施例中，该环结构包含具有seq id no:3的序列或具有与seq id no:3的序列具有约90％同一性的序列的核酸序列。在一些实施例中，该rnai从5’至3’包含该第二链、该rna接头和该第一链。在一些实施例中，该rnai从5’至3’包含该第一链、该rna接头和该第二链。在一些实施例中，该rnai包含具有seqid no:7的序列或具有与seq id no:7的序列具有约90％同一性的序列的核酸。在一些实施例中，该rnai是小抑制性rna(sirna)、微rna(mirna)或小发夹rna(shrna)。
2、在本专利技术的一些实施例中，该rnai进一步包含支架。在一些实施例中，该支架包含seq id no:11的核酸的全部或一部分。在一些实施例中，该mirna嵌入该支架内。在一些实施例中，该支架具有5’臂和3’臂，其中该5’臂位于编码该rnai的核酸的5’，其中该3’臂位于编码该rnai的核酸的3’。在一些实施例中，该支架是mir-155支架。在一些实施例中，该mir-155支架包含位于该rnai的5'的具有seq id no:9的序列或与seq id no:9的序列具有约90％同一性的序列的核酸。在一些实施例中，该mir-155支架包含位于该rnai的3'的具有seq id no:10的序列或与seq id no:10的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
3、在本专利技术的一些实施例中，该rnai靶向编码与肌强直性营养不良1型(dm1)相关的多肽的rna。在一些实施例中，该多肽是营养不良性肌强直蛋白激酶(dmpk)。在一些实施例中，该dmpk包含与dm1相关的突变。在一些实施例中，编码dmpk的基因包含5个或更多个ctg三核苷酸重复序列。
4、在一些方面，本专利技术提供了一种表达盒，该表达盒包含编码本文所述的任何rnai的核酸。在一些实施例中，编码该rnai的核酸与启动子可操作地连接。在一些实施例中，该启动子是肌肉特异性启动子。在一些实施例中，该启动子是结蛋白启动子或其变体。在一些实施例中，该结蛋白启动子包含一个或多个增强子元件、和人结蛋白基因的启动子。在一些实施例中，该结蛋白启动子包含两个增强子元件、和该人结蛋白基因的启动子。在一些实施例中，该结蛋白启动子包含一个或多个byrne增强子元件和/或一个或多个paulin增强子元件。在一些实施例中，该结蛋白启动子包含：包含seq id no:21的核苷酸序列或与seq idno:21的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件，和/或包含seq idno:22的核苷酸序列或与seq id no:22的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件。在一些实施例中，该结蛋白启动子包含seq id no:12的核苷酸序列或与seqid no:12的核苷酸序列具有约90％同一性的序列。在一些实施例中，该表达盒进一步包含内含子。在一些实施例中，该内含子是兔β-珠蛋白内含子。在一些实施例中，该内含子包含seq id no:13的核苷酸序列或与seq id no:13的序列具有约90％同一性的序列。在一些实施例中，编码该rnai的核酸嵌入该内含子中。在一些实施例中，该内含子包含5'臂和3'臂，其中该5'臂位于编码该rnai的核酸的5'并且该3'臂位于编码该rnai的核酸的3'。在一些实施例中，该内含子的5'臂包含seq id no:14的核苷酸序列或与seq id no:14的序列具有约90％同一性的序列。在一些实施例中，该内含子的3'臂包含seq id no:15的核苷酸序列或与seq idno:15的序列具有约90％同一性的序列。在一些实施例中，该表达盒进一步包含聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，该聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号、sv40聚腺苷酸化信号或hsv tk pa。在一些实施例中，该聚腺苷酸化信号是最小牛生长激素聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，该牛生长激素聚腺苷酸化信号包含seq id no:16的核苷酸序列或与seq id no:16的序列具有约90％同一性的序列。在一些实施例中，该表达盒包含seqid no:17的核苷酸序列或与seq id no:17的序列具有约90％同一性的序列。
5、在一些方面，本专利技术提供了一种表达盒，其中该表达盒包含经修本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含第一链和第二链的RNAi，其中
2.如权利要求1所述的RNAi，其中该非指导区包含具有序列5’-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3’(SEQ ID NO:2)或具有与SEQ ID NO:2的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
3.如权利要求1或2所述的RNAi，其中该第一链包含具有SEQ ID NO:1的序列的核酸，并且该非指导区包含具有SEQ ID NO:2的序列的核酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi，其中该第一链和该第二链借助于能够形成环结构的RNA接头连接。
5.如权利要求4所述的RNAi，其中该RNA接头包含约4至约50个核苷酸。
6.如权利要求4或5所述的RNAi，其中该环结构包含约4至约20个核苷酸。
7.如权利要求4-6中任一项所述的RNAi，其中该环结构包含具有SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:3的序列具有约90％同一性的序列的核酸序列。
8.如权利要求4-7中任一项所述的RNAi，其中该RNAi从5’至3’包含该第二链、该
9.如权利要求4-7中任一项所述的RNAi，其中该RNAi从5’至3’包含该第一链、该RNA接头和该第二链。
10.如权利要求1-8中任一项所述的RNAi，其中该RNAi包含具有SEQ ID NO:7的序列或具有与SEQ ID NO:7的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的RNAi，其中该RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的RNAi，其中该RNAi进一步包含支架。
13.如权利要求12所述的RNAi，其中该支架包含SEQ ID No:11的核酸的全部或一部分。
14.如权利要求13所述的RNAi，其中该miRNA嵌入该支架内。
15.如权利要求14所述的RNAi，其中该支架具有5’臂和3’臂，其中该5’臂位于编码该RNAi的核酸的5’，其中该3’臂位于编码该RNAi的核酸的3’。
16.如权利要求12-15中任一项所述的RNAi，其中该支架是miR-155支架。
17.如权利要求12-16中任一项所述的RNAi，其中该miR-155支架包含位于该RNAi的5’的具有SEQ ID NO:9的序列或与SEQ ID NO:9的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
18.如权利要求12-17中任一项所述的RNAi，其中该miR-155支架包含位于该RNAi的3’的具有SEQ ID NO:10的序列或与SEQ ID NO:10的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的RNAi，其中该RNAi靶向编码与肌强直性营养不良1型(DM1)相关的多肽的RNA。
20.如权利要求19所述的RNAi，其中该多肽是营养不良性肌强直蛋白激酶(DMPK)。
21.如权利要求20所述的RNAi，其中该DMPK包含与DM-1相关的突变。
22.如权利要求20或21所述的RNAi，其中编码DMPK的基因包含5个或更多个CTG三核苷酸重复序列。
23.一种表达盒，该表达盒包含编码如权利要求1-22中任一项所述的RNAi的核酸。
24.如权利要求23所述的表达盒，其中编码该RNAi的核酸与启动子可操作地连接。
25.如权利要求24所述的表达盒，其中该启动子是肌肉特异性启动子。
26.如权利要求24或25所述的表达盒，其中该启动子是结蛋白启动子或其变体。
27.如权利要求26所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含一个或多个增强子元件、和人结蛋白基因的启动子。
28.如权利要求26或27所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含两个增强子元件、和该人结蛋白基因的启动子。
29.如权利要求26-28中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含一个或多个Byrne增强子元件和/或一个或多个Paulin增强子元件。
30.如权利要求26-29中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含：包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与SEQ ID NO:21的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含第一链和第二链的rnai，其中
2.如权利要求1所述的rnai，其中该非指导区包含具有序列5’-acccuagaugucuucgauu-3’(seq id no:2)或具有与seq id no:2的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
3.如权利要求1或2所述的rnai，其中该第一链包含具有seq id no:1的序列的核酸，并且该非指导区包含具有seq id no:2的序列的核酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的rnai，其中该第一链和该第二链借助于能够形成环结构的rna接头连接。
5.如权利要求4所述的rnai，其中该rna接头包含约4至约50个核苷酸。
6.如权利要求4或5所述的rnai，其中该环结构包含约4至约20个核苷酸。
7.如权利要求4-6中任一项所述的rnai，其中该环结构包含具有seq id no:3的序列或具有与seq id no:3的序列具有约90％同一性的序列的核酸序列。
8.如权利要求4-7中任一项所述的rnai，其中该rnai从5’至3’包含该第二链、该rna接头和该第一链。
9.如权利要求4-7中任一项所述的rnai，其中该rnai从5’至3’包含该第一链、该rna接头和该第二链。
10.如权利要求1-8中任一项所述的rnai，其中该rnai包含具有seq id no:7的序列或具有与seq id no:7的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的rnai，其中该rnai是小抑制性rna(sirna)、微rna(mirna)或小发夹rna(shrna)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的rnai，其中该rnai进一步包含支架。
13.如权利要求12所述的rnai，其中该支架包含seq id no:11的核酸的全部或一部分。
14.如权利要求13所述的rnai，其中该mirna嵌入该支架内。
15.如权利要求14所述的rnai，其中该支架具有5’臂和3’臂，其中该5’臂位于编码该rnai的核酸的5’，其中该3’臂位于编码该rnai的核酸的3’。
16.如权利要求12-15中任一项所述的rnai，其中该支架是mir-155支架。
17.如权利要求12-16中任一项所述的rnai，其中该mir-155支架包含位于该rnai的5’的具有seq id no:9的序列或与seq id no:9的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
18.如权利要求12-17中任一项所述的rnai，其中该mir-155支架包含位于该rnai的3’的具有seq id no:10的序列或与seq id no:10的序列具有约90％同一性的序列的核酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的rnai，其中该rnai靶向编码与肌强直性营养不良1型(dm1)相关的多肽的rna。
20.如权利要求19所述的rnai，其中该多肽是营养不良性肌强直蛋白激酶(dmpk)。
21.如权利要求20所述的rnai，其中该dmpk包含与dm-1相关的突变。
22.如权利要求20或21所述的rnai，其中编码dmpk的基因包含5个或更多个ctg三核苷酸重复序列。
23.一种表达盒，该表达盒包含编码如权利要求1-22中任一项所述的rnai的核酸。
24.如权利要求23所述的表达盒，其中编码该rnai的核酸与启动子可操作地连接。
25.如权利要求24所述的表达盒，其中该启动子是肌肉特异性启动子。
26.如权利要求24或25所述的表达盒，其中该启动子是结蛋白启动子或其变体。
27.如权利要求26所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含一个或多个增强子元件、和人结蛋白基因的启动子。
28.如权利要求26或27所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含两个增强子元件、和该人结蛋白基因的启动子。
29.如权利要求26-28中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含一个或多个byrne增强子元件和/或一个或多个paulin增强子元件。
30.如权利要求26-29中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含：包含seq idno:21的核苷酸序列或与seq id no:21的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件，和/或包含seq id no:22的核苷酸序列或与seq id no:22的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件。
31.如权利要求26-30中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含seq id no:12的核苷酸序列或与seq id no:12的核苷酸序列具有约90％同一性的序列。
32.如权利要求23-31中任一项所述的表达盒，其中该表达盒进一步包含内含子。
33.如权利要求32所述的表达盒，其中该内含子是兔β-珠蛋白内含子。
34.如权利要求32或33所述的表达盒，其中该内含子包含seq id no:13的核苷酸序列或与seq id no:13的序列具有约90％同一性的序列。
35.如权利要求32-34中任一项所述的表达盒，其中编码该rnai的核酸嵌入该内含子中。
36.如权利要求35所述的表达盒，其中该内含子包含5’臂和3’臂，其中该5’臂位于编码该rnai的核酸的5’并且该3’臂位于编码该rnai的核酸的3’。
37.如权利要求36所述的表达盒，其中该内含子的5’臂包含seq id no:14的核苷酸序列或与seq id no:14的序列具有约90％同一性的序列。
38.如权利要求36或37所述的表达盒，其中该内含子的3’臂包含seq id no:15的核苷酸序列或与seq id no:15的序列具有约90％同一性的序列。
39.如权利要求23-38中任一项所述的表达盒，其中该表达盒进一步包含聚腺苷酸化信号。
40.如权利要求39所述的表达盒，其中该聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号、sv40聚腺苷酸化信号或hsv tk pa。
41.如权利要求40所述的表达盒，其中该聚腺苷酸化信号是最小牛生长激素聚腺苷酸化信号。
42.如权利要求39-41中任一项所述的表达盒，其中该牛生长激素聚腺苷酸化信号包含seq id no:16的核苷酸序列或与seq id no:16的序列具有约90％同一性的序列。
43.如权利要求23-42中任一项所述的表达盒，其中该表达盒包含seq id no:17的核苷酸序列或与seq id no:17的序列具有约90％同一性的序列。
44.一种表达盒，其中该表达盒包含经修饰的结蛋白启动子，其中该经修饰的结蛋白启动子包含一个或多个增强子元件、和人结蛋白基因的启动子。
45.如权利要求44所述的表达盒，其中该经修饰的结蛋白启动子包含两个增强子元件、和该人结蛋白基因的启动子。
46.如权利要求44或45所述的表达盒，其中该经修饰的结蛋白启动子包含一个或多个byrne增强子元件和/或一个或多个paulin增强子元件。
47.如权利要求44-46中任一项所述的表达盒，其中该经修饰的结蛋白启动子包含：包含seq id no:21的核苷酸序列或与seq id no:21的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件，和/或包含seq id no:22的核苷酸序列或与seq id no:22的序列具有约90％同一性的核苷酸序列的一个或多个增强子元件。
48.如权利要求44-47中任一项所述的表达盒，其中该结蛋白启动子包含seq id no:12的核苷酸序列或与seq id no:12的核苷酸序列具有约90％同一性的序列。
49.如权利要求44-48中任一项所述的表达盒，其中该表达盒进一步包含内含子。
50.如权利要求49所述的表达盒，其中该内含子是兔β-珠蛋白内含子。
51.如权利要求49或50所述的表达盒，其中该内含子包含seq id no:13的核苷酸序列或与seq id no:13的序列具有约90％同一性的序列。
52.如权利要求44-51中任一项所述的表达盒，其中编码转基因的核酸嵌入该内含子中。
53.如权利要求52所述的表达盒，其中该内含子包含5’臂和3’臂，其中该5’臂位于该编码转基因的核酸的5’并且该3’臂位于该编码转基因的核酸的3’。
54.如权利要求53所述的表达盒，其中该内含子的5’臂包含seq id no:14的核苷酸序列或与seq id no:14的序列具有约90％同一性的序列。
55.如权利要求53或54所述的表达盒，其中该内含子的3’臂包含seq id no:15的核苷酸序列或与seq id no:15的序列具有约90％同一性的序列。
56.如权利要求44-55中任一项所述的表达盒，其中该表达盒进一步包含聚腺苷酸化信号。
57.如权利要求56所述的表达盒，其中该聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号、sv40聚腺苷酸化信号或hsv tk pa。
58.如权利要求57所述的表达盒，其中该聚腺苷酸化信号是最小牛生长激素聚腺苷酸化信号。
59.如权利要求56-58中任一项所述的表达盒，其中该牛生长激素聚腺苷酸化信号包含seq id no:16的核苷酸序列或与seq id no:16的序列具有约90％同一性的序列。
60.如权利要求44-59中任一项所述的表达盒，其中该转基因编码多肽或核酸。
61.如权利要求44-60中任一项所述的表达盒，其中该转基因编码rnai。
62.一种载体，该载体包含如权利要求23-61中任一项所述的表达盒。
63.如权利要求62所述的载体，其中该表达盒的侧翼是一个或多个填充核酸序列。
64.如权利要求63所述的载体，其中该一个或多个填充核酸序列源自人serpina1基因。
65.如权利要求63或64所述的载体，其中位于该表达盒5’的填充核酸序列源自该人serpina1基因。
66.如权利要求63-65中任一项所述的载体，其中位于该表达盒5’的填充序列包含seqid no:18的核苷酸序列或与seq id no:18的序列具有约90％同一性的序列。
67.如权利要求63-66中任一项所述的载体，其中位于该表达盒3’的填充核酸序列源自该人serpina1基因。
68.如权利要求63-67中任一项所述的载体，其中位于该表达盒3’的填充序列包含seqid no:19的核苷酸序列或与seq id no:19的序列具有约90％同一性的序列。
69.如权利要求62-68中任一项所述的载体，其中该载体是重组腺相关病毒(raav)载体。
70.如权利要求69所述的raav载体，其中该表达盒的侧翼是一个或多个aav反向末端重复(itr)序列。
71.如权利要求70所述的raav载体，其中该表达盒的侧翼是两个aav itr。
72.如权利要求70或71所述的raav载体，其中这些aav itr是...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·程，S·M·雅克布，T·森口，C·奥里奥丹，G·阮，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：
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