【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和废弃物资源化领域，具体涉及高效代谢几丁质合成紫色杆菌素的工程菌株以及甲壳类废弃物的高值生物转化技术。
技术介绍
1、全球每年产生近千万吨甲壳类废弃物，它们通常被填埋或者倾倒入海。这类废弃物含有大量几丁质，是一种由n-乙酰氨基葡萄糖（glcnac）通过β-1，4-糖苷键组成的生物多聚糖。因此，甲壳类废弃物进入环境后会导致水体富营养化、致病菌传播等环境和健康问题。甲壳类废弃物的不当处置不仅导致环境污染，也会造成资源浪费。实现甲壳类废弃物的资源化利用为以上问题提供有经济价值的解决途径。
2、目前，较为成熟的甲壳类废弃物资源化途径是通过化学处理方法从废弃物中提取几丁质，然后加工为壳聚糖产品。然而，该生产工艺需要消耗大量酸碱，获得的壳聚糖异质性高，限制了产品的应用场景。尽管可以通过复杂的化学处理工艺将几丁质转化为3-乙酰氨基-5-乙酰基呋喃、1-o-甲基-n-乙酰氨基葡萄糖等高值化合物，但是这种工艺受限于严苛的操作条件、巨大的能量消耗和试剂消耗而难以规模化生产。近年来快速发展的合成生物学技术有望解决上述挑战。例如，研究者开发了利用机械化学耦合酶解及微生物合成的技术，将几丁质转化为酪氨酸和多巴胺化合物。然而，机械球磨水解几丁质需要消耗大量电能，主要的水解产物是底盘微生物不能直接代谢利用的寡聚糖。转化工艺的成本昂贵，因此难以规模化应用。几丁质废弃物亟需一种环保、绿色、高效的新型资源化技术。
3、紫色素杆菌具有一定的几丁质水解能力和高值生物活性物质的合成能力，是实现几丁质高值资源化转化的理想底盘微
技术实现思路
1、本专利技术的目的是建立一种甲壳类废弃物的新型资源化方法。降低甲壳类废弃物资源化工艺的成本，提高资源化产物的经济价值。通过对紫色素杆菌（chromobacteriumviolaceum）的基因工程改造，获得了可以高效代谢几丁质合成紫色杆菌素的工程菌株，实现了废弃几丁质向紫色杆菌素的全生物法高效转化。
2、本专利技术提供了一株可高效代谢几丁质合成高值化合物的新型高产菌株。本专利技术选择紫色素杆菌作为底盘微生物，通过基因工程改造，强化了底盘微生物利用几丁质作为唯一碳源和氮源代谢生长的能力，并显著提升紫色素杆菌在几丁质作为唯一碳源和氮源时合成紫色杆菌素的产量。
3、本专利技术提供了紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
4、本专利技术所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，使用阿拉伯糖诱导型启动子和质粒pyydt构建。
5、本专利技术还提供了紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌的cv_1440、cv_2935和cv_4240基因以及紫色杆菌素合成基因簇vioabcde过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如seq idno.1、no.2和no.3所示，所述紫色杆菌素合成基因簇vioabcde序列如seq id no.5所示。
6、本专利技术所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio，其特征在于，使用阿拉伯糖诱导型启动子和质粒pyydt构建。
7、本专利技术还提供了所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi在水解几丁质和/或处理甲壳类废弃物中的用途。
8、本专利技术还提供了所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio在水解几丁质和/或处理甲壳类废弃物和/或合成紫色杆菌素中的用途。
9、本专利技术提供了利用几丁质和/或甲壳类废弃物合成紫色杆菌素的方法，其特征在于，所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi和/或所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio处理几丁质和/或甲壳类废弃物。
10、本专利技术所述的利用几丁质和/或甲壳类废弃物合成紫色杆菌素的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
11、（a）将所述几丁质和/或由所述甲壳类废弃物获得的几丁质作为碳源和/或氮源制备发酵培养液；和
12、（b）将所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi和/或所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio转接入几丁质发酵培养液中，30℃发酵。
13、本专利技术所述的利用几丁质和/或甲壳类废弃物合成紫色杆菌素的方法还包括使用l-阿拉伯糖诱导处理。
14、本专利技术提供了一种利用上述新型工程菌株将甲壳类废弃物高效合成紫色杆菌素的新型方法。该方法包括，利用预处理技术从甲壳类废弃物中获得几丁质，将几丁质作为上述新型工程菌株的唯一碳源和氮源，实现高价值化合物紫色杆菌素的高效合成。
15、本专利技术提供一套适用于紫色素杆菌的表达载体工具，增强工程菌株水解几丁质和合成紫色杆菌素的能力。所构建的表达载体包括：
16、以pyydt质粒载体，阿拉伯糖诱导型启动子调控基因表达，共表达关键几丁质酶和紫色杆菌素合成基因簇，得到重组表达质粒pyydt-chivio。从而获得代谢几丁质合成紫色杆菌素的紫色素杆菌工程菌株。
17、在本专利技术的实施方式中，所述工程菌株的构建方法包括：
18、（1）利用pcr扩增紫色素杆菌基因组中的三种几丁质酶基因（cv_4240、cv_1440、cv_2935）和紫色杆菌素合成基因簇（cv_vioa、cv_viob、cv_vioc、cv_viod、cv_vioe）。并且，从pyydt质粒扩增含有阿拉伯糖诱导型启动子parabad的质粒骨架dna片段，采用无缝克隆方法将这些基因片段整合为表达质粒pyydt-chivio。
19、（2）将pyydt-chivio质粒转染入紫色素杆菌中，获得本专利技术的工程菌株wt/pyydt-chivio。
20、进一步，本专利技术还提供了一种将甲壳类废弃物转变为紫色杆菌素的方法，包括如下步骤：
21、（1）从甲壳类废弃物中提取几丁质。收集餐厨废弃物螃蟹壳，清洗壳废弃物之后干燥。经过稀盐酸、氢氧化钠溶液、过氧化氢浸泡三轮预处理后，干燥几丁质并用磨粉机剪切为碎片。制备几丁质作为唯一碳源和氮源的发酵培养液。
22、（2）将上述工程菌株培养至平台期后，再转接入几丁质发酵培养液中。在30℃培养四天后，可见白色几丁质被彻底水解，培养液紫色变深。离心收集菌体，用无水乙醇提取紫色杆菌素。
23、紫色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-Chi，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-Chi，其特征在于，使用阿拉伯糖诱导型启动子和质粒pYYDT构建。
3.紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-ChiVio，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌的cv_1440、cv_2935和cv_4240基因以及紫色杆菌素合成基因簇vioABCDE过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如SEQ ID NO.1、NO.2和NO.3所示，所述紫色杆菌素合成基因簇vioABCDE序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求3所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-ChiVio，其特征在于，使用阿拉伯糖诱导型启动子和质粒pYYDT构
5.权利要求1或2所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-Chi在水解几丁质和/或处理甲壳类废弃物中的用途。
6.权利要求3或4所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-ChiVio在水解几丁质和/或处理甲壳类废弃物和/或合成紫色杆菌素中的用途。
7.利用几丁质和/或甲壳类废弃物合成紫色杆菌素的方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-Chi和/或权利要求3或4所述的紫色素杆菌工程菌株WT/pYYDT-ChiVio处理几丁质和/或甲壳类废弃物。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用L-阿拉伯糖诱导处理。
...【技术特征摘要】
1.紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
2.权利要求1所述的紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chi，其特征在于，使用阿拉伯糖诱导型启动子和质粒pyydt构建。
3.紫色素杆菌工程菌株wt/pyydt-chivio，其特征在于，以野生型紫色素杆菌为出发菌，紫色素杆菌的cv_1440、cv_2935和cv_4240基因以及紫色杆菌素合成基因簇vioabcde过表达，所述紫色素杆菌cv_1440、cv_2935和cv_4240基因序列分别如seq id no.1、no.2和no.3所示，所述紫色杆菌素合成基因簇vioabcde序列如seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：何汝立，吴洁，
申请(专利权)人：中国科学技术大学先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。