【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分离纯化，尤其涉及一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法。
技术介绍
1、胰高血糖素样肽-1(glp-1)是一种由胃肠内分泌细胞产生的肽类物质，属于一种肠促胰岛素，能够通过多种途径来控制血糖，在调节食欲方面扮演着至关重要的角色。然而，由于glp-1在体内快速降解和短暂生物活性的特性，glp-1本身并不适合直接用于治疗糖尿病和肥胖症。为了克服这一限制，科学家们开始致力于研究glp-1类似物，旨在获得更为稳定和持久的生物活性。glp-1类似物的广泛应用有望为糖尿病和肥胖症等代谢性疾病的治疗带来新的希望，从而改善患者的生活质量并减轻全球医疗负担。
2、近年来，随着基因工程和生物技术的飞速发展，glp-1类似物的研究也取得了显著进展。通过基因工程技术，研究人员成功构建了能够大量表达glp-1类似物的菌株，为其产量的提高打下了坚实基础。然而，由于glp-1类似物在发酵液中与其他蛋白质和杂质共存，传统的分离纯化方法存在操作复杂、产率低和纯度不高等问题，制约了其在临床应用中的进一步推广。
3、目前，对发酵液中glp-1类似物分离纯化的领域，尚未出现有效可行的技术方法。
技术实现思路
1、为了实现发酵液中glp-1类似物的分离纯化，本专利技术提供了一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、本专利技术提供了一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化
4、在0~30℃下，往glp-1类似物发酵液中添加无机盐和亲水性有机溶剂，混悬均匀，调节ph为8.5~10.5，离心使体系分相，取上相通过肠激酶酶切后采用反向制备液相色谱法进行纯化处理；其中：
5、以体系的总质量计，无机盐的添加量为10%~35%，亲水性有机溶剂的添加量为15%~40%；
6、无机盐选自柠檬酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸钠中的一种或多种；
7、亲水性有机溶剂选自乙醇、叔丁醇、正丙醇、异丙醇中的一种或多种；
8、glp-1类似物发酵液的蛋白浓度为9~13mg/ml。
9、作为上述方法的优选，无机盐为磷酸氢二钾。
10、作为上述方法的优选，亲水性有机溶剂为乙醇。
11、作为上述方法的优选，以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~24%。
12、作为上述方法的优选，以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~17%。
13、作为上述方法的优选，以体系的总质量计，亲水性有机溶剂的添加量为16%~26%。
14、作为上述方法的优选，调节ph为9.5。
15、作为上述方法的优选，所述纯化处理的方法为：将肠激酶酶切得到的glp-1类似物粗产物溶解于tris缓冲液后，上样于反向制备液相色谱柱，收集21min出峰位置的峰产物，其中：反向制备液相色谱分离的流动相为：a(含0.1%（体积分数）tfa的水)、b(0.1%tfa（体积分数）的乙腈)；样品上样溶液为10%（体积分数）乙腈溶液；色谱柱为 sepax bio-c8（10μm，21.2*250mm）；洗脱条件为：0-5 min，5%b；5-5.5min，5-30%b；5.5-30 min，30%-80%b；30-30.5min，80-100%b；30.5-35min，100%b；35-35.5min，100-5%b；35.5-40 min，5% b；然后下一批循环。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
17、（1）本专利技术针对glp-1类似物发酵液，通过调节亲水性有机溶剂和可溶性无机盐之间的比例，形成两个水相层，从而实现了glp-1类似物的高效富集，为glp-1类似物的分离纯化提供了一条全新的技术途径，进一步地，高效富集后的粗产物可以通过反向制备液相色谱法进行纯化处理，得到高纯度的glp-1类似物。本专利技术提供的方法填补了发酵液中glp-1类似物分离纯化领域的技术空白。
18、（2）本专利技术还针对能实现glp-1类似物发酵液的高效富集的双水相萃取体系，给出了最优的萃取条件，比如，优选的亲水性有机溶剂和可溶性无机盐、优选的ph条件、优选的温度条件、优选的蛋白浓度条件等，使发酵液中glp-1类似物的分离纯化效果达到最优化。
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1.一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：无机盐为磷酸氢二钾。
3.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：亲水性有机溶剂为乙醇。
4.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~24%。
5.如权利要求4所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~17%。
6.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，亲水性有机溶剂的添加量为16%~26%。
7.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：
8.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中GLP-1类似物的方法，其特征在于：所述纯化处理的方法为：将肠激酶酶切得到的GLP-1类似物粗产物溶解于Tris缓冲液后，上样于反向制备液相色谱柱，收集21min出峰位置的峰产物，其中：反向制备液相色谱分离的流动相为：A(含0.1%（体积分数）TFA的水)、B(0.1%TFA（体积分数）的乙腈)；样品上样溶液为10%（体积分数）乙腈溶液；色谱柱为 Sepax Bio-C8（10μm，21.2*250mm）；洗脱条件为：0-5 min，5%B；5-5.5min，5-30%B；5.5-30 min，30%-80%B；30-30.5min，80-100%B；30.5-35min，100%B；35-35.5min，100-5%B；35.5-40 min，5% B；然后下一批循环。
...【技术特征摘要】
1.一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：无机盐为磷酸氢二钾。
3.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：亲水性有机溶剂为乙醇。
4.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~24%。
5.如权利要求4所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，无机盐的添加量为13%~17%。
6.如权利要求1所述的一种双水相萃取耦合反相柱层析分离纯化发酵液中glp-1类似物的方法，其特征在于：以体系的总质量计，亲水性有机溶剂的添加量为16%~26%。
...【专利技术属性】
技术研发人员：项宁，邢醴天，余亚希，邹子楠，徐绍兴，王旭东，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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