【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋鱼类细胞培养，具体涉及一种许氏平鲉精巢细胞系及其构建方法和应用。
技术介绍
1、许氏平鲉（ sebastes schlegelii），俗称黑头，属硬骨鱼纲、鲉形目、平鲉科、平鲉属。主要分布在我国的黄海、渤海及东海一带，是适应我国北方深远海网箱养殖的优势物种之一。其肉质鲜美，营养价值高，是具有较高开发潜力和研究价值的水中珍品。建立海洋鱼类细胞系对于病毒攻击、基因编辑及转基因技术等提供了良好的实验材料。与体内实验相比，具有重复性高、操作简单、成本低、实验周期短等优点。
2、许氏平鲉具有雌雄生长二态性，同龄雌性个体比雄性个体大25%以上，因此对于性别相关机制的解析显得尤为重要。近年来在许氏平鲉性别决定研究方面，已成功筛选出 amhy雄性性别决定基因，并且克隆出多种性别相关基因。然而，由于缺乏性腺细胞系作为体外实验的材料，使得性别相关基因的研究受到极大限制。同时，有研究表明生殖干细胞的培养需要依托于性腺体细胞系为饲养层，这对于其体外增殖、体外精子发生等具有重要作用。
3、目前，关于许氏平鲉细胞系构建的报道较少，仅建立了许氏平鲉成肌细胞系，未见有关该鱼种性腺组织细胞系建立的报道。建立许氏平鲉精巢细胞系对于其性别相关基因的体外功能研究以及繁殖和育种具有深远意义。
技术实现思路
1、鉴于以上现有技术的不足，本专利技术提供一种许氏平鲉精巢细胞系及其构建方法和
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一方面，本专利技术涉及一种许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤：
4、（1）许氏平鲉精巢组织的取样：选择许氏平鲉幼鱼，取精巢组织，置于含抗生素的磷酸盐缓冲液中；
5、（2）细胞的原代培养：将精巢组织在含抗生素的磷酸盐缓冲液中清洗，期间剔除精巢组织周围的血管、结缔组织和杂质，直至精巢组织最终呈深黑色；随后，将精巢组织移入含抗生素的 l-15培养基中，将组织剪成糜状，静置后弃上清；用含抗生素的 l-15培养基重悬组织块，静置后弃上清；将组织块进行酶消化处理；终止消化，将混合物经过细胞筛网，收集组织块；将组织块转移至细胞培养瓶，倒置培养使组织贴壁后加入完全培养基进行培养；观察细胞迁出情况，定期更换完全培养基；
6、所述完全培养基为：以l-15培养基为基础培养基，向基础培养基中添加胎牛血清、mem非必需氨基酸、青链霉素混合液、丙酮酸钠、谷氨酰胺、巯基还原剂溶液、许氏平鲉胚胎提取物、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子；
7、（3）细胞的传代培养：待细胞丰度达到70%-90%时进行传代，传代比例为1:1~2。
8、优选的，步骤（3）包括：
9、待细胞丰度达到70%-90%时进行传代；首次传代的比例为1:1，随后的传代比例为1:2或者2:3；根据细胞生长情况，每3-5天传代一次。
10、更优选的，步骤（3）包括：
11、待细胞丰度达到70%-90%时进行传代，首次传代的比例为1:1，第2~4代的传代比例为1:2，第5~20代的传代比例为2:3，20代之后的传代比例为1:2。
12、优选的，所述的完全培养基为：以l-15培养基为基础培养基，向基础培养基中添加20v/v%胎牛血清、1v/v% mem非必需氨基酸、1v/v%青链霉素混合液、1 mm丙酮酸钠、2 mm谷氨酰胺、1v/v‰巯基还原剂溶液、1v/v%许氏平鲉胚胎提取物、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml表皮生长因子。l-15培养基和胎牛血清为细胞提供丰富的蛋白质等营养物质；非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的加入可以促进细胞增殖，提高细胞活性；巯基还原剂溶液作为强还原剂，能够中和细胞培养基中积累的氧自由基；胚胎提取物能够提供蛋白质、多肽和生长因子等，促进细胞的增殖和分化；青链霉素混合液作为抗生素，能够抑制细菌生长，避免细胞污染。
13、优选的，所述的许氏平鲉胚胎提取物的制备方法如下：
14、收集处于体节期且健康的胚胎，于磷酸盐缓冲液中清洗；将胚胎置于冰上研磨至无可见大块碎片，将匀浆液于液氮-37 ℃水浴反复冻融；将匀浆液于4 ℃、3500 g离心，转移上清于新的离心管中，4 ℃，18000 g离心30 min，中间呈亮黄色的物质即为许氏平鲉胚胎提取物。
15、胚胎提取物能够提供精巢细胞生长所必须的营养物质和细胞因子，若将该物质从完全培养基中去除，精巢细胞会逐渐停止增殖并从培养瓶中脱落下来。因此我们认为，许氏平鲉胚胎提取物对于其精巢细胞系的建立具有至关重要的作用。
16、优选的，所述抗生素为青链霉素混合液，青链霉素混合液的使用量为1~5w/w%。
17、优选的，所述酶消化处理包括：使用终浓度为0.25w/w%胰蛋白酶和1 mg/ml胶原酶iv的酶液进行消化处理1h。
18、优选的，所述定期更换完全培养基为每2-3天更换一半量的完全培养基。
19、第二方面，本专利技术涉及一种许氏平鲉精巢细胞系，其通过采用前述的构建方法制得。
20、第三方面，本专利技术涉及所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法或所述的许氏平鲉精巢细胞系在性别相关基因研究中的应用。
21、进一步说明，本领域技术人员可以理解，细胞丰度指的是细胞在培养容器中的覆盖程度。具体来说，当细胞的丰度达到70~90%时，意味着培养容器表面大约有70~90%被细胞覆盖。细胞传代指的是将原培养瓶中的细胞按照一定比例稀释并转移到新的培养容器中继续培养的过程。1:1比例意味着原培养瓶中的细胞被等量地转移到一个新的培养瓶或皿中。细胞传代比例为1:2意味着将细胞数量平均分配到两个新的培养容器中进行传代培养。
22、本专利技术所取得的有益效果：
23、本专利技术成功构建了首个许氏平鲉精巢细胞系。该细胞呈成纤维样，分裂旺盛，传代频率高，目前已稳定传代60余次，能够提供大量的许氏平鲉精巢细胞用于体外实验。经过染色体鉴定和分子特异性标记鉴定，确定该细胞系为正常二倍体细胞且特异性表达基质细胞标记基因 timp2，这为性别相关基因的功能研究提供了良好的体外材料。
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1.一种许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）包括：
3.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）包括：
4. 根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所述的完全培养基为：以L-15培养基为基础培养基，向基础培养基中添加20v/v%胎牛血清、1v/v% MEM非必需氨基酸、1v/v%青链霉素混合液、1 mM丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺、1v/v‰巯基还原剂溶液、1v/v%许氏平鲉胚胎提取物、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL表皮生长因子。
5.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所述的许氏平鲉胚胎提取物的制备方法如下：
6.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所述抗生素为青链霉素混合液，青链霉素混合液的使用量为1~5w/w%。
7.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在
8.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所述定期更换完全培养基为每2-3天更换一半量的完全培养基。
9.一种许氏平鲉精巢细胞系，其特征在于，采用权利要求1~8任一项所述的构建方法制得。
10.权利要求1~8任一项所述的构建方法或权利要求9所述的许氏平鲉精巢细胞系在性腺发育相关基因研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）包括：
3.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）包括：
4. 根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所述的完全培养基为：以l-15培养基为基础培养基，向基础培养基中添加20v/v%胎牛血清、1v/v% mem非必需氨基酸、1v/v%青链霉素混合液、1 mm丙酮酸钠、2 mm谷氨酰胺、1v/v‰巯基还原剂溶液、1v/v%许氏平鲉胚胎提取物、10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml表皮生长因子。
5.根据权利要求1所述的许氏平鲉精巢细胞系的构建方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺艳，高向玉，宋宗诚，宋伟豪，岳新璐，齐洁，张全启，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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