【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物光学显微成像，尤其涉及一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，在光片荧光显微镜中应用类艾里照明光束和探测物镜景深增强(轴锥透镜、三次相位掩膜板对探测光路进行波前编码)实现成像视场增强。
技术介绍
1、长期以来，光学成像技术作为生物医学研究的重要工具，允许研究人员对生物及细胞的构成要素及其动态过程进行有效的观测。其中，光片荧光显微成像方法因其特殊的照明、探测光路设计，具有高时间分辨率，低光毒性和光漂白等特性，同时还能兼顾成像空间分辨率和成像深度，使得研究人员能够长时间观察活体样本的生命活动，对生命科学研究具有重要的意义。
2、传统的光片显微镜使用的高斯光束沿传播方向的截面半径呈现出双曲线的特征，其瑞利长度相对较短，导致了高斯光片荧光显微镜的视场相当有限：在高斯光束的束腰处，成像的轴向分辨率最好；一旦超出瑞利范围，高斯光束的衍射效应会迅速显现，其分辨能力显著降低，表现出了高斯光片在成像过程中存在轴向分辨率与视场的制约。此外，活体生物样本往往是不透明的，对光具有强吸收及散射作用，高斯光片易受上述光子—组织相互作用的影响，导致深层组织成像质量降低。
3、无衍射光束尤其是艾里光束(airy beam)经常被应用于提升光片荧光显微镜的成像视场。艾里光束由于其空间相干性低，受样本不均匀性的影响较小，在较宽的视场上具有高对比度和均匀的分辨率，从而能够得到较长的成像视场。但艾里光片显微镜同样存在不足，其自弯曲特性导致在视场两侧，艾里光束的主瓣和旁瓣均会超出探测物镜的景深范围，影响两侧荧光信号的
4、增大景深的最经典方法就是缩小物镜的通光孔径。增大物镜的数值孔径可以使高斯光束的束腰处直径减小，瑞利距离随之减小。普通的成像系统的点扩散函数(pointspread function,psf)就是高斯形，可以通过缩小孔径光阑的大小使探测物镜的数值孔径减小，从而达到增大景深的目的。随着物镜孔径减小，成像系统的景深逐渐增大，但光瞳减小会减少光信号的传递，不利于荧光信号收集，导致成像结果对比度变差。
5、此外，波前编码是一种常用于非相干成像系统扩展景深的光学方法，通过在光瞳平面上引入优化的相位掩膜，对系统的光学传递函数(otf)进行调制，使其具有离焦不变性。三次相位掩膜是用固定相位法推出的最原始的相位掩膜。通过使用波前编码技术在光片显微镜中扩展检测光学元件的景深，使得在扩展的轴向范围内的任何地方都能容纳光片，从而能够在样品上实现快速扫描光片，因此成像过程中不需要位移台的机械位移，仅对光片进行轴向扫描便可进行大体积的成像，减少了机械位移产生的伪影，提高了探测物镜的景深范围。
6、但波前编码也有一定的局限性，要想实现最优的成像效果，需对相位掩膜的参数进行优化处理，并不简单易行，同时相位掩膜板制作工艺复杂，定制价格高昂。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，本专利技术有效减弱生物组织的散射吸收作用，更适宜大体积生物样本成像；且能够显著增大探测光路的成像深度，详见下文描述：
2、一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，所述方法包括：
3、将光源发出的光束整形滤波成类艾里光束；
4、光束通过扫描振镜形成照明光片；照明光片在激发物镜焦点处聚焦，激发样本池中的样本，产生荧光信号；
5、探测物镜与锥透镜、筒镜结合，收集焦平面的荧光信号，经滤光片滤除杂散光后在相机上成像。
6、其中，所述将光源发出的光束整形滤波成类艾里光束为：
7、改变相位的幂次数改变生成光束的自弯曲度，调制之后的相位公式为：
8、pairy-like(u,v)＝r(u,v)exp[2pαi[sign(u,v)(u2+v2)+(u3+v3)+…]]
9、将这种幂次叠加生成的光束称作类艾里光束，pairy-like(u,v)为调制产生艾里光束的相位，r(u,v)为光瞳孔径函数，α为艾里光束的比例因子，i为虚数单位，u,v为归一化坐标。
10、其中，所述光束通过扫描振镜形成照明光片为：
11、锥透镜置于物镜和筒镜之间，将一个点光源放置在物镜之前的不同位置z，对点光源进行衍射，并在相机上进行成像，通过移动点光源的轴向z位置，得到探测光路的轴向psf；
12、添加锥透镜后的探测光路psf呈现贝塞尔形，在z＝0μm位置，psf聚成环状，将改造之后的探测光路psf能量最高的位置z＝-620μm处定义为改造后的光路聚焦位置；
13、通过控制变量，选取底角为1°或0.5°的锥透镜成像；采用平凸锥透镜成像获得更强的光强和更低廉的成本；改变锥透镜的通光孔径大小来改变探测光路psf的轴向强度分布，选取通光孔径较大的锥透镜；保证锥透镜与物镜的光轴重合。
14、其中，所述应用三次相位掩膜版探测光路的psf呈现出艾里形状为：
15、将三次相位掩膜板放置在探测物镜和筒镜之间，将一个点光源放置在物镜之前的不同位置z，对点光源进行衍射，并在相机上进行成像，通过移动点光源的轴向z位置，得到探测光路的轴向psf及mtf图像；
16、添加三次相位掩膜版后的探测光路psf呈艾里分布，改造后的光路在z＝0μm～15μm距离内mtf曲线保持平缓，在此距离内都能够保持一定的信息传递能力。
17、通过控制变量，将三次相位掩膜至于物镜后d1＝0mm位置使其产生最好的波前调制作用；改变相位掩膜版的比例因子，可以增大其景深调制的范围。但由于艾里形psf的自弯曲特性，焦平面两侧的成像结果会出现位移，对后期的图像处理产生较大影响。
18、本专利技术提供的技术方案的有益效果是：
19、1)本专利技术相较于传统艾里光片所提出的类艾里光片，在保持一定分辨能力的同时，可以获得更大的成像视场，达到1220μm，与轴向分辨率相同的na＝0.175和α＝25的艾里光片相比增大视场7％和5％；景深扩展的艾里光片能够获得490μm的成像视场，相较于艾里光片视场增强约36％；景深扩展的类艾里光片能够获得1300μm的成像视场，相较于类艾里光片视场增强约46％；
20、2)本专利技术类艾里光片的强度聚焦在视场两侧，能够有效减弱生物组织的散射吸收作用，更适宜大体积生物样本成像；
21、3)本专利技术能够显著增大探测光路的成像深度，在本专利技术设定的基本参数条件下，探测光路的景深能增大至1000μm以上，相对普通探测光路增大了50倍；
22、4)本专利技术通过实验证明了视场增强艾里光片显微成像系统能够为创伤性脑损伤的治疗提供新的方法。
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1.一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述将光源发出的光束整形滤波成类艾里光束为：
3.根据权利要求1所述的一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述光束通过扫描振镜形成照明光片为：
4.根据权利要求3所述的一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述应用三次相位掩膜版探测光路的PSF呈现出艾里形状为：
【技术特征摘要】
1.一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种基于类艾里光束和探测物镜景深增强的视场拓展方法，其特征在于，所述将光源发出的光束整形滤波成类艾里光束为：
3.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳鹏飞，李宏伟，张殿康，李渊，王燕妮，王启仲，张晓东，马慧珍，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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