【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫检测，涉及一种用于偶联抗体的羧基化纳米微球及其制备方法和应用。
技术介绍
1、乳胶增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，petia)是一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。相较于目前科学研究中主流的酶联免疫吸附法(elisa)，省去了孵育、洗板等繁琐步骤，短时间内就能够获得检测结果。且乳胶增强免疫比浊法相对于胶体金层析法具有更高的灵敏度，可用于定量检测。
2、相较于传统免疫比浊法，乳胶增强免疫比浊法是在高分子纳米微球表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的纳米微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的反射光性能或透射光性能。目前petia检测试剂所使用的纳米微球多为羧基化微球或氨基化微球。现代科学研究中纳米微球与抗体结合主要包括物理吸附和化学偶联两种方法。由于乳胶微球表面带有磺酸基、羧基、醛基等均属于疏水性微球，都能够设计用以被动物理吸附抗体，疏水吸附方法只能用于疏水微球(磺酸基、羧基、醛基表面修饰的微球)。虽然物理吸附是不依赖ph的，但反应缓冲液的ph对抗体的结构有非常大的影响，从而影响抗体吸附到微球上的反应效率，一般在被吸附抗体的等电点附近ph时，具有较高的物理吸附效率。对于抗体而言，其fc端的疏水性较fab端强。这种性质可以保证抗体是通过fc端与微球结合，从而不会影响吸附后抗体与抗原的特异性结合。
3、纳米微球结合抗体的另一种方法为化学偶联。羧基化纳米微球与抗体的结合是通过纳米微球表面的羧基功
4、虽然使用edc/nhs能够活化纳米微球偶联抗体，但edc/nhs可能会对抗体的正常生理功能结构产生不利影响。现在使用的一步法/两步法进行的纳米微球偶联抗体实验，所用edc为非定量使用，且多余用量的edc/nhs难以随着后续洗涤、离心步骤除去，在后续偶联抗体步骤时会与抗体表面游离羧基发生反应，使得抗体结构产生损伤，影响抗体正常生理功能，进而对后续乳胶增强免疫比浊法体外检测试剂的检测效果产生抑制效果。且后续偶联抗体时需抗体过量使用才能保证理论上相应的偶联效率，但此举可能会导致抗体的使用量过高产生不必要的浪费。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于偶联抗体的羧基化纳米微球及其制备方法和应用。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于偶联抗体的羧基化纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
4、s1、用活化剂对噻唑啉类酰化剂进行活化；
5、s2、使用活化后的噻唑啉类酰化剂活化羧基化纳米微球；
6、s3、将活化后的羧基化纳米微球进行纯化，即得。
7、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s1中，所述噻唑啉类酰化剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-噻唑啉-2-硫醇、4-氨基噻唑啉-2-硫酮、苯并噻唑啉、2-甲硫基-2-噻唑啉中的至少一种。
8、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s1中，所述活化剂包括1-羟基苯丙三氮唑、乙二酰氯、4-三氟甲基苯甲酸酐、2-甲基-6-硝基苯甲酸酐、n,n-二异丙基甲酰胺、过氧单磺酸钾、三氟乙酸中的至少一种。优选地，所述活化剂为过氧单磺酸钾。
9、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s1中，所述噻唑啉类酰化剂与活化剂的质量比例为1:1～1:4。优选地，所述噻唑啉类酰化剂与活化剂的质量比例为1:3～1:4。
10、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s1中，活化的方法包括将噻唑啉类酰化剂与活化剂在溶剂中溶解孵育；活化的时间为3-10min。优选地，所述噻唑啉类酰化剂的使用浓度为5-20mg/ml。
11、进一步地，所述溶剂包括乙醇溶液。在一些优选实施例中，所述乙醇溶液的质量百分比为75％。
12、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s2中，所述活化后的噻唑啉类酰化剂与羧基化纳米微球的用量比为10-100mg：0.5-1.5ml。在一些优选实施例中，所述羧基化纳米微球的固含量为10％。
13、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s2中，活化的时间为15-25min。
14、作为本专利技术的一个实施方案，步骤s3中，所述纯化的方法包括：将活化后的羧基化纳米微球第一次加热，离心，将沉淀重悬后第二次加热，离心。在一些实施例中，所述纯化包括重复以上步骤2-3次。
15、进一步地，所述第一次加热和第二次加热均为在50-60℃水浴加热下孵育10-30min。
16、进一步地，所述离心的转速为10000-20000rpm。
17、第二方面，本专利技术提供一种如所述制备方法得到的用于偶联抗体的羧基化纳米微球。
18、第三方面，本专利技术提供一种抗体致敏纳米颗粒，所述抗体致敏纳米颗粒通过将羧基化纳米微球与抗体进行偶联孵育而得。
19、在一些优选实施例中，所述抗体包括肌红蛋白(myo)抗体。
20、第四方面，本专利技术提供一种如所述抗体致敏纳米颗粒在制备petia检测试剂盒中的应用。
21、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
22、1、与传统一步法或两步法活化羧基化纳米微球操作相比，本专利技术放弃使用会对抗体正常生理功能结构产生有害效果的edc/nhs等生物交联剂，转而使用无害的、具有更高活化效率的噻唑啉类酰化剂作为活化纳米微球的酰化剂，经活化剂活化后，可以提高抗体与微球的偶联效率，避免了对抗体产生的不利影响，使偶联形成的抗体致敏纳米颗粒具有优异的检测灵敏度和线性检测范围。
23、2、传统偶联方法中，在向纳米微球悬液中加入edc/nhs后可能会导致纳米微球产生聚集沉降的现象，这是由于edc/nhs能够与纳米微球表面羧基活性基团发生反应生成不稳定的活性酯中间体，此举会消耗大量纳米微球表面羧基活性基团，导致纳米微球表面由于羧基活性基团而产生的高zeta电位降低，进而使得纳米微球稳定性降低，有聚集沉降的趋势，所以向纳米微球悬液中加入edc/nhs后会产生纳米微球聚集沉降的现象。本专利技术在酰化剂消耗纳米微球表面羧基活性基团导致纳米微球表面zeta电位降低本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于偶联抗体的羧基化纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述噻唑啉类酰化剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-噻唑啉-2-硫醇、4-氨基噻唑啉-2-硫酮、苯并噻唑啉、2-甲硫基-2-噻唑啉中的至少一种；所述活化剂包括1-羟基苯丙三氮唑、乙二酰氯、4-三氟甲基苯甲酸酐、2-甲基-6-硝基苯甲酸酐、N,N-二异丙基甲酰胺、过氧单磺酸钾、三氟乙酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述噻唑啉类酰化剂与活化剂的质量比为1:1～1:4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，活化的方法包括将噻唑啉类酰化剂与活化剂在溶剂中溶解孵育；所述溶剂包括乙醇溶液；活化的时间为3-10min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述噻唑啉类酰化剂与活化剂的质量比例为1:1～1:4。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述活化后的噻唑啉类酰化剂与羧基化纳
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述纯化的方法包括：将活化后的羧基化纳米微球第一次加热，离心，将沉淀重悬后第二次加热，离心。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述制备方法得到的用于偶联抗体的羧基化纳米微球。
9.一种抗体致敏纳米颗粒，其特征在于，所述抗体致敏纳米颗粒通过将权利要求8所述的羧基化纳米微球与抗体进行偶联孵育而得。
10.一种如权利要求9所述的抗体致敏纳米颗粒在制备PETIA检测试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于偶联抗体的羧基化纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述噻唑啉类酰化剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-噻唑啉-2-硫醇、4-氨基噻唑啉-2-硫酮、苯并噻唑啉、2-甲硫基-2-噻唑啉中的至少一种；所述活化剂包括1-羟基苯丙三氮唑、乙二酰氯、4-三氟甲基苯甲酸酐、2-甲基-6-硝基苯甲酸酐、n,n-二异丙基甲酰胺、过氧单磺酸钾、三氟乙酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述噻唑啉类酰化剂与活化剂的质量比为1:1～1:4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，活化的方法包括将噻唑啉类酰化剂与活化剂在溶剂中溶解孵育；所述溶剂包括乙醇溶液；活化的时间为3-10min。
【专利技术属性】
技术研发人员：李金星，房君江，
申请(专利权)人：上海睿康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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