【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及下一代测序和核酸文库制备的领域。
技术介绍
1、下一代测序是一种新兴技术，其扩展到生物医学研究和临床诊断的所有领域。
2、用于下一代测序的仪器具有有限的读长(测序引物下游的分子数，其序列可以被准确确定)。在许多应用中，该读长不足以确定目标完整dna片段的序列。因此，称为文库制备的过程是测序应用的重要组成部分。为此，将待测序的dna片段成倍增加，并且多个拷贝随后通过称为片段化的过程缩短。对这些片段进行测序，并将获得的序列与参考序列对齐，以确定完整片段的序列。
3、基于片段化的文库制备工作流程的理想结果是获得均匀覆盖待测序的dna分子的dna文库分子(图4a)。然而，基于片段化的文库制备工作流程的典型文库显示未片段化dna的比例很高(10x genomics用户指南cg000208rev e；chromiumnext gem single cell 5'reagentkits v2，第4.6节，第57页)，这是文库制备过程中的主要缺点(示例如图4b所示)。
4、对于包含许多未片段化核酸的文库，显示通过测序获得的许多读取源自富集靶标的最3'端(例如，按照10x genomics用户指南cg000208rev e/10x genomics chromiumnextgem single cell 5'reagentkits v2生成的文库)。为了确保从较短的片段中获得足够的读取，必须增加测序读取的数量。这导致更高的成本，因为必须增加样品的读取数量，因此必须减少可以并行测序的不同样品的数量。
5、此外，来自初始靶向富集的引物二聚体可能存在于文库中。这尤其发生在同时扩增多个靶标的靶向富集中(在这些多重反应中，不可能设计无一将形成引物二聚体的大量引物)。这些引物二聚体通常也在文库制备过程中被继续携带，并且也将被测序。
6、引物二聚体(没有关于靶标的信息)和未片段化(靶标的覆盖度不均匀)的存在只能通过增加读取的数量来补偿。这导致成本增加或较低的覆盖度。
7、这里我们描述了一种用于核酸文库制备的改进或替代方法，以减少未片段化核酸的数量，从而避免对这些分子进行测序。因为可以减少测序读取的数量，这使得测序更准确，并且节省了成本。该方法还可用于减少引物二聚体的数量。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是一种用于获得包含多核苷酸的样品的核酸文库的方法，所述方法包括以下步骤：
2、a.向所述多核苷酸提供多种修饰的引物，其中所述修饰的引物是用于核酸扩增的聚合酶的起点；
3、b.使用聚合酶扩增所述多核苷酸；
4、c.将扩增的多核苷酸片段化，从而获得包含所述修饰的引物的片段化和未片段化多核苷酸的混合物；
5、d.将多种接头寡核苷酸与步骤c)中获得的混合物连接，从而获得包含所述接头寡核苷酸的多核苷酸混合物，其中所述接头寡核苷酸包含用于扩增引物的结合位点；
6、e.向步骤d)中获得的混合物提供扩增引物，其中所述扩增引物是用于核酸扩增的聚合酶的起点；
7、f.通过提供聚合酶启动核酸扩增。
8、关键的因素是修饰的引物。步骤a)中提供的修饰的引物包含官能团。官能团是位于所述修饰的引物的5'端的封闭基团(图2)，从而阻止接头寡核苷酸的连接，或者所述官能团是至少一种核苷酸类似物，并且其中核苷酸类似物在步骤d)之后被核酸内切酶切除，从而去除由接头寡核苷酸提供的引物结合位点(图3)。由此，阻止了步骤f)中提供的扩增引物的结合和包含修饰的引物的片段化多核苷酸的核酸扩增。
9、此外，还阻止了引物二聚体的扩增。
10、本专利技术的方法可以与(pct/ep/2020/081731)中公开的统计学片段化技术相结合。在这种方法中，一种核苷酸类似物在扩增过程中掺入核酸中。所述核苷酸类似物被核酸内切酶切除，从而产生片段化的核酸文库。
11、通过本专利技术的方法获得的靶标核酸文库可用于测序。对于测序，可以使用本领域已知的任何方法。
12、定义
13、除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
14、如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”在提及组合物、方法及其各自的组分中使用，所述组分对于所述方法或组合物是必不可少的，但仍可能包含未指定的要素(无论是否必不可少)。
15、词语“结合”和“杂交”及其语法等价物可以互换使用。如果两条核酸链彼此互补，它们就会发生杂交。杂交可在本领域已知的条件下发生。
16、如本文所用，术语“互补的”是指通过watson和crick碱基配对在两个核苷酸之间精确配对的能力。解释一下，如果核酸链给定位置的核苷酸能够与另一条核酸链的核苷酸形成氢键，那么这两个核酸在该位置被认为是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时，它可以是完全的。
17、本文使用的“引物”是由核苷酸制成的单链寡核苷酸，它能够与互补核酸序列结合。应理解，本专利技术中描述的所有引物都可以作为核酸合成/扩增的起点。根据本专利技术，可以使用修饰的引物。这种修饰的引物包含官能团，并且能够阻止接头分子的连接或能够从多核苷酸中去除。根据本专利技术，官能团是位于所述修饰的引物的5'端的封闭基团，或者所述官能团是包含在修饰的引物中的至少一种核苷酸类似物。修饰的引物也可以称为“修饰的靶向富集引物”。此外，未修饰的引物也可用于所公开的方法。这些引物不携带能够阻止接头分子的连接或能够从多核苷酸中去除的官能团。本文使用的扩增引物也具有未修饰的引物的特性。
18、本文使用的术语“核酸合成”和核酸扩增可以互换使用。核酸合成的过程是本领域众所周知的。简而言之：对于核酸合成，提供模板核酸，其可以是单链或双链的。在初始使用双链核酸的情况下，第一步是使用本领域已知的技术变性成单核酸链(互补和反向互补的)。单链核酸不需要变性步骤。在下一步中，提供与核酸链的互补区域结合的引物。然后使用聚合酶延伸引物的3'端，并通过填充互补核苷酸产生互补链。结果形成了互补的核酸链。为了进一步扩增，需要双链核酸变性，然后可启动另一轮核酸合成。根据本专利技术，核酸合成可以是对称的或不对称的。在对称核酸合成过程中，仅使用一种引物。因此，仅合成一条链。在对称反应过程中，可以提供一对两种引物(正向引物和反向引物)。一种引物与互补核酸链结合，另一种引物与反向互补核酸链结合。因此，可以在两条链上启动核酸合成。除非另有说明，否则本文中使用的词语“引物”可以包括正向引物、反向引物或两者。在具体实施方案中，词语“具有相同特异性的引物”涉及所有使用的正向引物或所有使用的反向引物。
19、本文中使用的术语“接头(adaptor)”或“接头(ad本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于获得包含多核苷酸的样品的核酸文库的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中进一步提供不包含官能团的多种未修饰的引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤a)中以90:10的摩尔比提供多种修饰和未修饰的引物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中提供的引物的至少50％是修饰的引物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭基团选自生物素、具有1至25个二醇单元的寡乙二醇和具有3至12个碳原子的碳间隔基团。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)提供的引物中用作官能团的核苷酸类似物选自8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤、脱氧尿苷、脱氧肌苷、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-甲酰尿嘧啶、3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N6-亚乙烯基腺嘌呤、次黄嘌呤、脱氧-8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤、
8.根据权利要求1-4和7中任一项所述的方法，其特征在于
9.根据权利要求1-4和7-8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)提供的引物中用作官能团的核苷酸类似物是8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤，并且步骤b)中提供的核苷酸类似物是脱氧尿苷。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于获得包含多核苷酸的样品的核酸文库的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中进一步提供不包含官能团的多种未修饰的引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤a)中以90:10的摩尔比提供多种修饰和未修饰的引物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中提供的引物的至少50％是修饰的引物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭基团选自生物素、具有1至25个二醇单元的寡乙二醇和具有3至12个碳原子的碳间隔基团。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·伯纳德瓦尔，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：
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