【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及氮氧同位素溯源，特别是涉及一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法。
技术介绍
1、氮化合物过量的进入环境水生生态系统中，流域内地表水的硝态氮浓度可能会快速升高，从而对地表水产生硝酸盐污染。它会导致有毒藻类的迅速增加，称为藻华(或赤潮)，这会耗尽水中的氧气，并可能造成影响水下生物的死亡区域，开展氮污染来源解析工作为重中之重。
2、地表水氮的来源很多，其中最受关注的是硝酸盐污染的溯源，由于不同硝酸盐来源的氮同位素比值有重叠现象，近年来人们开始采用氮氧双同位素方法和端元混合模型，以更准确地判断硝酸盐的来源并研究其生物地球化学过程，随着科技发展和精准治污提出，定性分析水体中氮的来源已经不能满足环境管理的需求，学者选择利用同位素技术结合模型定量技术获得各类污染源的贡献率，常用的有isosource，siar(稳定同位素源解析模型)等。但其适合应用于大尺度流域，溯源精度相对较小。
3、污染源具有独特的生物条形码特征，目前使用较多的sourcetracker微生物来源分析河流污染物的来源、周围工厂、农田、养殖厂对河流污染的贡献。利用微生物条形码不能将生物特征与氮污染来源进行耦合分析，且污染源水体输入地表水后微生物特征发生生物地球化学过程，因此需要筛选出可以指示不同氮污染源的地表水指示微生物指纹图谱，为地表水硝态氮污染溯源提供新的方法与思路。
4、现有技术氮氧同位素溯源技术测定繁琐、溯源精度小，面对小流域或平原河网地区时甚至无法区分来源；微生物指纹溯源仅能表示污染源与监测地表水样本之间微生物之间的关
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，包括：
4、对目标流域的地表水样品进行样品收集，得到水体样品；
5、测定所述水体样品的氮同位素比值和氧同位素比值；
6、测序所述水体样品的微生物条形码；
7、基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用贝叶斯同位素混合模型计算出不同氮污染来源组的贡献率，并将不同氮污染来源的贡献率进行分组；
8、通过r语言运算indicspecies程序包计算各组不同的指示物种指数，以筛选出指示物种，并根据所述微生物条形码构建氮污染来源微生物图谱；
9、根据所述氮污染来源微生物图谱获得指示地表水中氮污染来源的微生物。
10、优选地，测定所述水体样品的氮同位素比值和氧同位素比值，包括：
11、取20ml所述水体样品于40ml顶空瓶中，加入0.1mlcdcl2溶液，然后加入0.8mlnh4cl溶液，最后加入3×10cm 4n洁净锌片，在摇床上以220r/min转速振荡15min；
12、取出锌片，密闭顶空瓶，完成no2-还原步骤；
13、向经no2-还原后的顶空瓶中加入1ml的nan3溶液和ch3cooh的1:1混合液，剧烈震荡使样品和试剂混匀。之后以220r/min转速振荡30min，最后加入0.6ml的naoh溶液作为终止剂，结束叠氮化反应；
14、用gas-bench-稳定同位素质谱仪联机测试n2o气体的氮同位素比值和氧同位素比值。
15、优选地，测序所述水体样品的微生物条形码，包括：
16、采用ctab/sds方法提取水体样品中的总基因组dna；
17、不同区域的16s rrna/18srrna/its基因用特定引物和条形码扩增；
18、将等体积的1x加载缓冲液与pcr产物混合，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，进行dna检测；
19、用ultratmiidna文库制备试剂盒生成测序文库；
20、根据条形码将成对的读数分配给水体样品，并通过切断条形码和引物序列来截断切断条形码和引物序列；
21、使用fastp软件对原始标签进行质量过滤，以获得高质量的清洁标签；
22、使用vsearch将清洁标签与参考数据库进行比较。以检测嵌合体序列，并将嵌合体序列去除，得到有效标签；
23、对于获得的有效标签，用qiime2软件中的dada2或deblur模块进行去噪处理；
24、使用qiime2软件进行物种注释和多序列比对；。
25、数据归一化
26、扩增子序列变异的绝对丰度用序列号的标准进行归一化处理，以序列号为标准，对应于序列最少的样品。
27、优选地，基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用贝叶斯同位素混合模型计算出不同氮污染来源组的贡献率，并将不同氮污染来源的贡献率进行分组，包括：
28、用δ表示硝酸盐的δ15n-no3-和δ18o-no3-同位素，并按下列公式计算：
29、δ(‰)＝(r样品/r标准-1)×1000；
30、其中，r样品和r标准分别表示样品/标准样品的n/n或o/o比值，即δ1514181615n-no3-和δ18o-no3-；n同位素以大气氮(n2)为参考标准；o同位素采用维也纳标准平均海水；
31、通过r语言运算贝叶斯同位素混合模型，量化潜在no3--n源对地表水的比例贡献；
32、按照比例贡献最大值分为多组。
33、优选地，贝叶斯同位素混合模型的公式为：其中，xij表示混合物i的同位素j的值，其中i＝1,2,3…n和j＝1,2,3…j；pk表示源k的贡献比例，由siar模型计算得到；sjk表示源k中同位素j的值，k＝1,2,3，…，k，符合平均值为μjk；标准偏差为的正态分布；cjk表示源k上同位素j的分馏因子，其正态分布为平均值λjk和标准偏差τjk；εjk代表剩余误差，是单个混合物之间未能确定的变量，服从平均值为0、标准偏差为σj的正态分布。
34、优选地，indicspecies程序包具有两个值提及的特征，包括通过自助法获得指示值的置信区间和通过不断尝试所有分类组组合情况依次选择合适的指示物种。
35、优选地，所述目标流域包括江、河、湖和海。
36、优选地，按照比例贡献最大值分为的多组具体包括：肥料来源组、土壤氮来源组和生活污水及粪便来源组。
37、根据本专利技术提供的具体实施例，本专利技术公开了以下技术效果：
38、本专利技术提供了一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，包括：对目标流域的地表水样品进行样品收集，得到水体样品；测定所述水体样品的氮同位素比值和氧同位素比值；测序所述水体样品的微生物条形码；基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用贝叶斯同位素混合模型计算出不同氮污染来源组的贡献率，并将不同氮污染来源的贡献率进行分组；通过r语言运算indicspecies程序包计算各组不同的指示物种指数，以筛选出指示物种，并根据所述微生物条形码构建氮污染来源微本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，测定所述水体样品的氮同位素比值和氧同位素比值，包括：
3.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，测序所述水体样品的微生物条形码，包括：
4.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用贝叶斯同位素混合模型计算出不同氮污染来源组的贡献率，并将不同氮污染来源的贡献率进行分组，包括：
5.根据权利要求4所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，贝叶斯同位素混合模型的公式为：其中，Xij表示混合物i的同位素j的值，其中i＝1,2,3…N和j＝1,2,3…J；pk表示源k的贡献比例，由SIAR模型计算得到；Sjk表示源k中同位素j的值，k＝1,2,3，…，K，符合平均值为μjk；标准偏差为的正态分布；Cjk表示源k上同位素j的分馏因子，其正态分布为平均值λjk和标准偏差τjk；εjk代表剩余误差，是单个混合物之间未能确定
6.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，indicspecies程序包具有两个值提及的特征，包括通过自助法获得指示值的置信区间和通过不断尝试所有分类组组合情况依次选择合适的指示物种。
7.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，所述目标流域包括江、河、湖和海。
8.根据权利要求4所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，按照比例贡献最大值分为的多组具体包括：肥料来源组、土壤氮来源组和生活污水及粪便来源组。
...【技术特征摘要】
1.一种地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，测定所述水体样品的氮同位素比值和氧同位素比值，包括：
3.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，测序所述水体样品的微生物条形码，包括：
4.根据权利要求1所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用贝叶斯同位素混合模型计算出不同氮污染来源组的贡献率，并将不同氮污染来源的贡献率进行分组，包括：
5.根据权利要求4所述的地表水硝态氮微生物指纹溯源方法，其特征在于，贝叶斯同位素混合模型的公式为：其中，xij表示混合物i的同位素j的值，其中i＝1,2,3…n和j＝1,2,3…j；pk表示源k的贡献比例，由siar模型计算得到；...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷坤，孙乾航，李江南，李晓光，徐香勤，吕旭波，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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