【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及中枢神经系统细胞特异性的mirna表达载体、腺相关病毒载体及其用途。
技术介绍
1、脑内主要构成细胞为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。神经元(neurons)是神经系统的基本功能单元，负责传递和处理信息。它们通过电信号和化学信号与其他神经元、肌肉细胞或腺体细胞进行通信。神经元的正常功能对于整个神经系统的健康和运作至关重要。在许多神经退行性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)中，神经元的损伤和死亡是主要病理特征。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，占整个胶质细胞的20％～40％。在中枢神经系统中它们执行着广泛的内稳态功能，如参与突触形成、维持细胞内外离子浓度恒定、参与神经递质的传递、形成并维持血脑屏障，为其他中枢神经系统常驻细胞提供支持等。在病理情况下，星形胶质细胞可以经历形态学和分子变化，以采用所谓的“反应性”状态，这可以改变它们的功能并改变它们的神经支持和神经毒性特性之间的平衡。少突胶质细胞(oligodendrocytes)是中枢神经系统(cns)中的一种重要的胶质细胞类型。它们的主要功能是生成髓鞘(myelin sheath)，这一结构包裹在神经元的轴突上，起到绝缘作用，能够显著提高神经冲动的传导速度。小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统(cns)中的常驻免疫细胞，具有类似于外周免疫系统中巨噬细胞的功能。它们在维持神经系统的健康、监测环境变化和响应损伤或感染方面发挥关键作用。
2、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，是目
3、目前源自天然或基因工程腺相关病毒(aav)的基因递送载体已成为人类基因治疗的焦点，由于其较低的免疫原性、稳定的基因表达水平和位点特异性整合能力，具有较好的安全性，在基因治疗领域的发展势头日益强劲，越来越多的临床试验将其用于各种治疗。在中枢神经系统中，aav是目前用于体内递送转基因至中枢神经系统的主要载体，其具有高效转基因转导的能力、高度可工程化的细胞靶向性、低毒性和克服物理屏障(包括血脑屏障)的潜力。目前的神经系统疾病治疗领域，我们常常使用特异性启动子的aav特异性感染某种特定类型细胞，以达到治疗疾病的目的。如，使用gfap启动子的aav感染星形胶质细胞，使用synapsin启动子的aav感染神经元，使用cd68启动子的aav感染小胶质细胞，使用olig2启动子的aav感染少突胶质细胞。
4、microrna(mirna)是一种内源性的微小非编码rna，长度一般在20-25个核苷酸之间，通过与靶向信使rna在3’未翻译区域的碱基配对来调节基因表达，广泛参与了多种关键生物和细胞过程，如凋亡、分化、发育、增殖、代谢及信号转导通路等。因此基于mirna的治疗方法可能是治疗各种疾病的有希望的潜在工具。
5、在中枢神经系统，microrna的重要生理功能和病理功能也逐步被发现。2017一篇nature研究证实，下丘脑的神经干细胞通过外泌体中的microrna控制着机体的衰老节奏。其中，最有代表意义的microrna即为mir-124。mir-124的丰度占脑内总microrna的25-48％，是中枢神经系统中表达量最高的microrna。mir-124可以促进神经再生和神经发育，抑制神经干细胞的分化，为中风、脑外伤，神经退行性疾病等疾病的神经修复提供了备选策略。
6、现有技术中，多种神经系统细胞亚型启动子经常用于驱动不同细胞特异性的靶基因mrna表达，然而，目前还没有特定的启动子可用于控制特定细胞类型中mirna的表达。
技术实现思路
1、针对上述的技术问题，本专利技术的第一方面旨在提供一种中枢神经系统特异性mirna表达载体，该载体通过转染至细胞内，在多西环素(dox)诱导的情况下，驱动荧光标记基因表达，进而实现mirna在转染细胞内特异性表达。
2、本专利技术第二方面提供一种中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体在提高mirna过表达中的用途，在多西环素诱导下，tre启动子驱动荧光标记基因表达，进而驱动mirna特异性表达。
3、本专利技术的第三方面提供一种中枢神经系统细胞特异性的腺相关病毒载体，该腺相关病毒被注射后，利用细胞特异性启动子驱动荧光基因表达，进一步实现mirna在特定细胞内特异性表达，可用于追踪特定细胞及靶向细胞治疗的优势。
4、本专利技术的第四方面提供一种中枢神经系统细胞特异性的腺相关病毒载体在提高mirna的特异性表达中的用途。
5、本专利技术的第五方面提供一种中枢神经系统细胞特异性的腺相关病毒载体在制备中枢神经系统神经炎症相关疾病的药物中的应用，例如脑出血、中风、脑外伤、神经退行性等疾病的神经修复。
6、为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
7、本专利技术的第一方面提供了一种中枢神经系统细胞特异性的mirna表达载体，用于构建特异性过表达的mirna载体，包括：ef1α启动子序列，诱导序列，tre启动子，荧光标记基因序列，trna序列，mirna序列，trna序列，sv40 poly(a)终止信号序列；
8、所述tre启动子序列如seq id no.1所示，所述trna序列如seq id no.3所示，所述sv40 poly(a)终止信号序列如seq id no.5所示，ef1α启动子序列如seq id no.6所示；
9、所述诱导序列为多西环素诱导激活序列，具体为3g反式激活物蛋白因子，核苷酸序列如seq id no.7所示；
10、所述特异性mirna过表达基因序列为在多西环素诱导系统下游掺入trna-mirna-trna，tre启动子驱动荧光标记基因表达，进而实现mirna表达。
11、第一方面方案的优选实施方式，所述mirna为mir-124-3p，序列如seq id no.4所示。
12、第一方面方案的优选实施方式，所述荧光标记基因序列为tre启动子驱动的egfp荧光标记基因序列，序列如seq id no.2所示。
13、本专利技术第二方面提供了第一方面所述的中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体在特定细胞(包括但不限于星形胶质细胞，少突胶质细胞，神经元，小胶质细胞等)中提高mirna过表达的用途，细胞特异性启动子驱动荧光标记基因表达，进而驱动mirna特异性表达。
14、第二方面方案的优选实施方式，所述的mirna特异性表达是在体内本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种中枢神经系统细胞特异性miRNA表达载体，用于构建过表达miRNA的载体，其特征在于，包括：Ef1α启动子序列，诱导序列，Tre启动子，荧光标记序列，tRNA序列，miRNA序列，SV40 poly(A)终止信号序列；
2.根据权利要求1所述的中枢神经系统细胞特异性miRNA表达载体，其特征在于，所述miRNA为miR-124-3P，序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的中枢神经系统细胞特异性miRNA表达载体，其特征在于，所述荧光标记基因序列为多西环素驱动的EGFP荧光标记基因序列，序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的中枢神经系统细胞特异性miRNA表达载体在提高miRNA过表达中的用途，其特征在于，多西环素诱导下，Tre启动子驱动荧光标记基因表达，进而驱动miRNA特异性表达。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miRNA特异性表达是在体外特异性表达。
6.一种中枢神经系统细胞特异性miRNA过表达腺相关病毒载体，其特征在于，包括：细胞特
7.根据权利要求6所述的中枢神经系统细胞特异性的miRNA过表达腺相关病毒载体，其特征在于，所述miRNA序列为miR-124-3P，序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种如权利要求6或7所述的中枢神经系统细胞特异性的miRNA过表达腺相关病毒载体在制备转基因试验动物模型中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经系统细胞特异性的miRNA表达载体为在星形胶质细胞中的miRNA表达；
10.一种如权利要求6所述的中枢神经系统细胞特异性的miRNA过表达腺相关病毒载体在制备中枢神经系统神经炎症相关疾病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体，用于构建过表达mirna的载体，其特征在于，包括：ef1α启动子序列，诱导序列，tre启动子，荧光标记序列，trna序列，mirna序列，sv40 poly(a)终止信号序列；
2.根据权利要求1所述的中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体，其特征在于，所述mirna为mir-124-3p，序列如seq id no.4所示。
3.根据权利要求1所述的中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体，其特征在于，所述荧光标记基因序列为多西环素驱动的egfp荧光标记基因序列，序列如seq id no.2所示。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的中枢神经系统细胞特异性mirna表达载体在提高mirna过表达中的用途，其特征在于，多西环素诱导下，tre启动子驱动荧光标记基因表达，进而驱动mirna特异性表达。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的mirna特异性表达是...
【专利技术属性】
技术研发人员：李天文，朱剑虹，王鹏，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：
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