【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药检测，具体涉及细叶铁线莲药材中黄酮成分含量测定方法。
技术介绍
1、细叶铁线莲（clematis aethusifolia turcz）是毛茛科铁线莲属草质藤本，又名芹叶铁线莲，蒙文名为“特穆日-敖日阳古”，夏季花盛开时采收，晒干或切段晒干，性味辛、微甘，热，轻，锐，燥，糙；有毒，有“破痞，调温，燥“协日乌素”,止腐，消肿，止泻”功效。主要用于寒痞，消化不良，寒性“协日乌素”病，“吾雅曼”病，黄水疮，创疡，水肿，寒泻。
2、现代研究表明，细叶铁线莲中分离鉴定的化学成分主要包括黄酮、木脂素、苯丙酸衍生物、香豆素、以及皂苷类等，其中黄酮类成分的活性苷元主要是槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素等。
3、本专利技术采用高效液相色谱法建立细叶铁线莲药材中黄酮成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的含量测定方法，为铁线莲属药材的质量控制以及提升和完善细叶铁线莲药材质量标准提供参考。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种细叶铁线莲药材中黄酮成分含量测定方法。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术所述的细叶铁线莲药材中黄酮成分含量测定方法，采用了高效液相色谱法同时测定了细叶铁线莲药材中主要黄酮有效成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的含量。本专利技术测定的主要有效成分均是黄酮类成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、改善心血管健康、吸收紫外辐射和抗过敏作用等生物活性作用。
4、本专利技术所述高效液相色
5、本专利技术所述的高效液相色谱法采用的色谱柱为uitimate xb-c18（4.6 mm×250mm，5 μm），该色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250 mm，柱内径为4.6 mm。本专利技术比较了150 mm与250 mm两种长度的c18色谱柱，结果发现使用150 mm长度的c18色谱柱，山柰酚与芹菜素分离度小于1.0，而使用250 mm的c18色谱柱可以使山柰酚与芹菜素的分离度大于1.5。
6、本专利技术所述色谱条件的流动相为甲醇 - 0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v），其中甲醇为有机相，磷酸水溶液为水相。
7、本专利技术比较了0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%磷酸水溶液作为水相，结果表明0.05%、0.1%磷酸水溶液作为水相，槲皮素和山柰酚色谱峰的拖尾因子大于1.05；0.3%、0.4%磷酸水溶液作为水相，山柰酚与芹菜素色谱峰的分离度小于1.5；0.2%磷酸水溶液作为水相，槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的色谱峰分离度均大于1.5，拖尾因子均在0.95 ～1.05之间，理论塔板数均大于3 000，因此选择0.2%磷酸水溶液作为水相。
8、本专利技术比较了甲醇与0.2%磷酸水溶液按照体积比40:60、45:55、50:50、55:45、60:40作为流动相，结果表明甲醇与0.2%磷酸水溶液按照体积比40:60、45:55作为流动相，槲皮素、山柰酚色谱峰分离度小于1.5，拖尾因子大于1.05；甲醇与0.2%磷酸水溶液按照体积比55:45、60:40作为流动相，木犀草素、芹菜素的色谱峰分离度小于1.5；甲醇与0.2%磷酸水溶液按照体积比50:50作为流动相，槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的色谱峰分离度均大于1.5，拖尾因子均在0.95 ～ 1.05之间，理论塔板数均大于3000，因此选择甲醇与0.2%磷酸水溶液按照体积比50:50作为流动相。
9、本专利技术所述的甲醇 - 0.5%磷酸水溶液（50:50, v/v）是无水甲醇与体积分数为1%的磷酸水溶液，按照体积比为50:50混合配制成的溶液。
10、本专利技术所述的甲醇为纯度≥99.9%的色谱级甲醇溶液。
11、本专利技术所述的供试品溶液制备方法为：细叶铁线莲样品先置40℃鼓风干燥箱24小时，取出，粉碎成细粉，精密称取细粉3 g，置具塞锥形瓶中，按1:20料液比加入甲醇溶液，超声提取（温度50℃，功率250w，频率40khz）1.5 h，冷却至室温，减压抽滤，滤液减压浓缩至干，残渣加入甲醇 - 25%盐酸溶液（4:1，v/v）混合液25 ml，摇匀，90℃水浴加热回流0.5 h，冷却至室温，过滤，滤液置25 ml容量瓶，加甲醇定容，摇匀，0.45 μm有机微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。黄酮化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在，黄酮苷元的检测需要通过柱前处理破坏黄酮化合物的糖苷键，生成黄酮苷元。因此，本专利技术选择先采用采用有机溶剂超声的方式提取黄酮，后加酸水解破坏糖苷键，生成黄酮苷元。
12、本专利技术所述的高效液相色谱法还包括对照品溶液的制备方法，其方法为：精密称定对照品槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素，分别加入甲醇溶解，摇匀，制得各对照品储备液；精密吸取槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素储备液，置同一容量瓶中，加甲醇定容，制备混合对照品溶液。
13、本专利技术所述的高效液相色谱法还包括空白溶液的制备方法，空白溶液方法为：不加铁线莲药材，其余操作同供试品溶液，制得空白溶液。
14、本专利技术的有益效果：
15、（1）本专利技术建立了高效液相色谱法同时对细叶铁线莲药材中的黄酮指标成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素进行定量测定研究并通过方法学验证，结果表明本方法科学、可行；
16、（2）本专利技术相较于分析黄酮糖苷化合物，利用分析主要黄酮苷元成分可更直观的反映细叶铁线莲药材的黄酮含量，有效减少对照品复杂导致的图谱无法有效分离，检测时间短，检测结果准确，简单易行；
17、（3）本专利技术的线性范围广，重复性良好，样品处理的方法稳定可行，所得供试品溶液在常温状态下具有良好的稳定性；
18、（4）本专利技术的方法稳定准确，可用于细叶铁线莲的质量评价，可为细叶铁线莲的质量标准的提升提供参考。
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1.细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定细叶铁线莲药材中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素四种黄酮苷元的含量。
2.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇 - 0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v）；流速为1.0 mL/min；检测波长为360 nm；柱温为25℃。
3.根据权利要求2所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述C18色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250 mm，柱内径为4.6 mm。
4.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中供试品溶液制备方法为：细叶铁线莲样品粉碎成细粉，精密称取细粉3g，置具塞锥形瓶中，按1:20料液比加入甲醇溶液，超声提取（温度50℃，功率250W，频率40kHz）1.5 h，冷却至室温，减压抽滤，滤液减压浓缩至干，残渣加入甲醇 - 25%盐酸溶
5.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液色谱法中对照品溶液制备方法为：精密称定对照品槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素，分别加入甲醇溶解，摇匀，制得各对照品储备液；吸取槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素储备液，置同一容量瓶中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液。
6.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为20 μL。
...【技术特征摘要】
1.细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定细叶铁线莲药材中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素四种黄酮苷元的含量。
2.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为c18色谱柱；流动相为甲醇 - 0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v）；流速为1.0 ml/min；检测波长为360 nm；柱温为25℃。
3.根据权利要求2所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述c18色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250 mm，柱内径为4.6 mm。
4.根据权利要求1所述的细叶铁线莲药材中多种黄酮成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中供试品溶液制备方法为：细叶铁线莲样品粉碎成细粉，精密称取细粉3g...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢和兵，吴浩震，尼玛次仁，白玛旦增，
申请(专利权)人：江苏神猴医药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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