【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程，具体地说，涉及一种在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体及应用。
技术介绍
1、在全球范围内，玉米（ zea maysl.）和高粱[ sorghum bicolor（l.）moench]是广泛种植的禾本科c4作物，它们不仅是重要的粮食作物，而且还是生产牲畜饲料和制造生物燃料的重要原材料。由于现阶段针对玉米和高粱的遗传转化技术存在周期长、成本高和效率低下等问题，限制了对它们基因功能的大规模、快速研究；同时这一技术限制也阻碍了在玉米和高粱等c4植物中快速、高通量地表达异源的功能性蛋白，如抗性相关蛋白、小肽、抗原决定簇和抗体等的研究。因此，开发稳定转基因技术的替代方法具有必要性。
2、研究表明，由病毒介导的过表达（virus-mediated overexpression，vox）技术可用于在植物中高通量、瞬时和快速表达蛋白，从而促进对植物基因功能的研究（gleba，klimyuk，&marillonnet，2007）。目前，在玉米中已报道了七种病毒可作为vox载体。这些病毒包括大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus）（cheuk&houde，2018）、大麦黄条纹花叶病病毒（barley yellow striate mosaic virus）（gao et al., 2019）、狐尾草花叶病毒（foxtail mosaic virus, fomv）（bouton e
3、马铃薯y病毒属病毒 (potyviruses, 分类地位属于 potyvirus属， potyviridae科) 是已知的最大的一类侵染植物的rna病毒，其自然寄主范围广泛，其中有一些种类仅侵染单子叶植物，包括玉米、甘蔗和高粱等在内的多种作物。该类病毒的基因组为正义单链rna，其与病毒编码的外壳蛋白一起组装形成长线状的病毒粒体。potyviruses作为vox载体具有以下优点：（1）相对于球状的病毒粒体，弯曲、长线状的病毒粒体能够通过适当地增加粒体长度，而实现在基因组rna中装载较大的外源插入片段；（2）由于potyviruses仅具有一条rna基因组，因此在构建vox载体时，只需考虑将异源基因编码区插入到病毒rna的编码框中即可；（3）研究表明，potyviruses的基因组中至少有六个不同位置可用于表达异源蛋白，其中p1/hc-pro和nib/cp连接处的位点是最常用于设计外源基因的插入位点，这也为通过一个载体表达多个蛋白提供了可能（mei et al., 2019；xie et al., 2021）。
4、鉴于potyviruses作为vox载体的这些优势，虽然已经开发了多种用于在双子叶植物中进行基因功能分析的病毒载体，如芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、李痘病毒和烟草脉带花叶病毒等（dolja et al., 1992；fernández-fernández et al., 2001；beauchemin etal., 2005；gao et al., 2012；xie et al., 2021），但能用于单子叶植物的potyviruses载体罕见报道。近期，尽管在玉米中scmv-mdmv-b分离物可改造为vox载体，但scmv-mdmv-bvox载体接种玉米幼苗需要借助于基因枪轰击技术（mei et al., 2019）。而基因枪轰击技术需要昂贵的金颗粒，并且需要特定的精密设备，接种效率低；而且，包括scmv-mdmv-b在内的大部分scmv分离物在玉米上会引起严重的花叶和植株矮化等症状，不利于对其介导的过表达基因后植物表型的观察和测定。因此，鉴定和改造引起轻微花叶症状的scmv分离物，以及摆脱基因枪轰击技术的限制将更适用于在玉米和高粱中vox载体的开发和基因功能的研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体及应用。
2、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体，其构建方法包括以下步骤：
3、（1）以大范围田间病毒病调查中偶然发现的侵染玉米仅引起轻花叶症状的甘蔗花叶病毒分离物scmv-mdu（其在ncbi中的登录号为oq948124）的基因组rna为模板，经rt-pcr扩增得到其基因组rna的全长cdna，然后克隆至pcb301载体中，构建得到侵染性克隆pscmdu；
4、（2）将侵染性克隆pscmdu中第10153-10179位核苷酸对应的nib（核内含体蛋白b）和cp（外壳蛋白）之间的蛋白酶切割位点对应的核苷酸序列进行加倍，且在加倍的序列之间插入了带 blni和 stui单酶切位点（ blni、 stui可被 apai, aflii, kpni, paci, smai, stui中任意2个酶切位点替代）的预期表达基因或报告基因编码区序列，得到在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体。
5、优选地，所述报告基因为 gfp，所构建的在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体为pscmdu::gfp。
6、进一步地，本专利技术病毒载体的全序列由seq id no:1~2依次连接而成。
7、第二方面，本专利技术提供含有所述病毒载体的生物材料，所述生物材料包括表达载体、工程菌或宿主细胞。
8、第三方面，本专利技术提供一种单子叶c4植物外源基因表达系统（scmv-mdu vox系统），所述表达系统是将外源基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.在单子叶C4植物中表达外源基因的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体的构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述报告基因为GFP，所构建的在单子叶C4植物中表达外源基因的病毒载体为pSCmDu::GFP。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体的全序列由SEQ ID NO:1~2依次连接而成。
4.含有权利要求1-3任一项所述病毒载体的生物材料，所述生物材料为表达载体、工程菌或宿主细胞。
5.单子叶C4植物外源基因表达系统，其特征在于，所述表达系统是将外源基因的编码区插入经Bln I和Stu I线性化的权利要求1-3任一项所述病毒载体中，并转化土壤杆菌得到的。
6.权利要求1-3任一项所述病毒载体或权利要求4所述生物材料或权利要求5所述表达系统的以下任一应用：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为单子叶C4植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于
...【技术特征摘要】
1.在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体的构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其特征在于，所述报告基因为gfp，所构建的在单子叶c4植物中表达外源基因的病毒载体为pscmdu::gfp。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体的全序列由seq id no:1~2依次连接而成。
4.含有权利要求1-3任一项所述病毒载体的生物材料，所述生物材料为表达载体、工程菌或宿主细胞。
5.单子叶c4植物外源基因表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，杜开通，彭得智，王皓，范在丰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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