【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，更具体的说是涉及一种游离alu115和alu247完全抗原、单克隆抗体及其应用。
技术介绍
0、技术背景
1、游离核酸dna(cfdna)由血液中的核dna片段组成，起源于体内的各种细胞。从凋亡细胞释放的dna片段通常长度为185至200个碱基对(bp)。相反，来自坏死细胞或者肿瘤细胞的cfdna片段更长，表明dna的无序分解更多。因此，高水平的长dna片段可以作为疾病潜在的标志。来自坏死的长dna片段(alu247)与代表总cfdna的短凋亡片段(alu115)的比值代表cfdna完整性的水平。因此，该比率越高，越有利于疾病发生和发展，成为可用于临床应用(非侵入性评估的新兴领域)的合适候选生物标志物，如产前诊断、癌症、糖尿病、心血管和神经系统疾病。
2、cfdna序列内含有大量的alu序列，alu序列是高度丰富的灵长类动物特异性短散布核元件，约占人类基因组的10％。由于它们优先位于基因丰富的区域，特别是在内含子和3'utr中，alu元件可以对宿主基因和邻近基因的表达发挥调节作用，其中aul115和alu247有利于成为疾病发生发展有效的标志基因。alu序列不直接编码蛋白质，但在基因表达调控、细胞增殖、分化、凋亡等生命过程中发挥着关键作用。近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，越来越多的alu序列被发现并证实与多种疾病的发生发展密切相关。因此，开发针对alu序列的高效研究工具显得尤为重要，其中非编码alu序列特异性抗体是不可或缺的一部分。
3、目前检测aul115和
4、目前常用的蛋白偶联技术有生物素/链霉亲和素、dcc/nhs(二环己基碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺)和edc/nhs(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺)法，以下是这几种方法的优缺点比较：
5、dcc方法：dcc是一种强效的羧基活化剂，能够高效地促进酰胺键的形成。dcc在有机溶剂中溶解度较好，适用于在有机相中的反应。dcc反应后生成的dcu(二环己基脲)虽然在一些溶剂中析出，但溶解度较高，难以完全去除，可能影响后续步骤。dcc不溶于水，限制了其在水性环境中的应用。
6、生物素/链霉亲和素(biotin/streptavidin)化学结合系统在生物化学和分子生物学中具有广泛的应用，生物素和链霉亲和素之间的结合具有极高的特异性，解离常数非常低(约为10^-14摩尔/升)，这种紧密而特异性的结合是快速的，并且能够承受ph、温度、有机溶剂和变性剂的极端作用。但其成本较高，样本中高浓度的生物素可能会对基于生物素/链霉亲和素系统的检测方法产生干扰和干扰免疫应答的产生，影响检测结果的准确性。
7、本专利技术通过筛选edc/nhs方法的条件来制备蛋白偶联物，首先edc易溶于水也溶于有机溶剂，避免了dcc水溶性差造成偶联效率低的问题，edc反应后产生的副产物相对容易通过水洗去除，从而得到较纯的产物，避免了dcc水溶性差造成污染和生物素/链霉亲和素造成的结果的干扰。nhs的存在可以稳定edc活化羧基后生成的中间体，从而提高偶联效率。
8、本专利技术通过杂交瘤技术开发出针对特定非编码alu115和alu247的高效特异性抗体，aul115和alu247抗体成功制备有望在免疫发光、elisa(酶联免疫吸附试验)以及免疫胶体金等技术中具有重要的意义。高质量的抗体制备可以确保检测结果的准确性和可靠性，为疾病的诊断、预防和控制提供重要依据。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种游离核酸alu115和alu247完全抗原、利用该完全抗原获得alu115和alu247单克隆抗体及其应用，为临床产前诊断、癌症、糖尿病、心血管和神经系统疾病提供了准确抗体。
2、实现上述专利技术目的具体技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供了一种游离核酸alu115和alu247完全抗原，所述完全抗原为alu半抗原与蛋白质载体偶联后形成，所述alu半抗原为含有氨基标记的alu115和alu247核酸片段。完全抗原的结构如图1所示，alu的模板序列如seq id no.1所示。
4、所述alu115和alu247完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)将含有氨基标记的dutp的sybr greenⅰbufferamix(成份组成包括：
6、20mm tris-so4、100mm kcl、0.3mm甜菜碱、20％甘油、0.2mm dntp、sybr greenⅰ和0.5mm mgcl2)通过引物扩增引入到alu115基因序列中，alu115的扩增体系如下：
7、
8、扩增程序如下：
9、
10、优选地，aul115基因的特异性引物序列如seq id no.2～3所示。
11、将含有氨基标记的dutp的sybr greenⅰbufferamix，通过引物扩增引入到alu247基因序列中，alu247的扩增体系和扩增程序同alu115。
12、优选地，aul247基因的特异性引物序列如seq id no.4～5所示。
13、(2)通过胶回收试剂盒纯化alu115和alu247核苷酸序列，，要求经过紫外分光光度计检测后，要求dna浓度不低于40ng/μl，od260/od280比值不低于1.80。
14、(3)采用edc/nhs法将牛血清白蛋白偶联alu115和alu247核酸片段，称取20mgbsa，40mg edc，使之充分溶解于2ml 0.1m mes ph5.0缓冲液中，加入20mg nhs，4℃避光搅拌反应15min后调至ph 8得到反应液为a液；分别将4mg纯化获得的alu115和alu247扩增产物逐滴加入到a液中(边加边搅拌)，密封，避光，在4℃下搅拌过夜；待上述反应完后，将反应液转移到透析袋中，4℃，用pbs透析2天，透析完成后保存备用。
15、另一方面，本专利技术提供了由所述完全抗原免疫得到的单克隆抗体。
16、所述alu115和alu247单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
17、(1)选择为4-6周龄的5只balb/c小鼠免疫动物进行免疫，将alu115-bsa和alu247-bsa作为免疫抗原，分别称取100μg抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化后(抗原浓度为1mg/ml)，背部皮下注射；2周后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种游离核酸ALU115和ALU247完全抗原，其特征在于：所述完全抗原为ALU半抗原与蛋白质载体偶联后形成，所述ALU半抗原分别为含有氨基标记的ALU115核酸片段和ALU247核酸片段。
2.根据权利要求1所述的游离核酸ALU115和ALU247完全抗原，其特征在于：所述蛋白质载体为牛血清白蛋白BSA。
3.如权利要求1或2所述的游离核酸ALU115和ALU247完全抗原的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，PCR反应体系为：12.5μLSYBR GreenⅠBufferAmix；taq酶0.5μL；ALU115和AUL247上下游引物各0.8μL；基因组DNA样本2μL；加入无菌水到25μL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述SYBR GreenⅠBuffer Amix的组成包括：20mM tris-SO4、100mM KCL、0.3mM甜菜碱、20％甘油、0.2mM dNTP、SYBR GreenⅠ和0.5mM MgCL2。>
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，扩增AUL115基因的特异性引物序列如SEQ ID No.2～3所示，扩增AUL247基因的特异性引物序列如SEQ ID No.4～5所示。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，具体偶联方法为：称取20mg BSA、40mg EDC，使之充分溶解于2mL 0.1M MES pH5.0缓冲液中，加入20mg NHS，4℃避光搅拌反应15min后调至pH 8得到反应液为A液；分别将4mg步骤(2)获得的ALU115和ALU247纯化扩增产物逐滴加入到A液中，密封，避光，在4℃下搅拌过夜；待上述反应完后，将反应液转移到透析袋中，4℃，用PBS透析2天，透析完成后保存备用。
8.如权利要求1或2所述的完全抗原免疫得到的单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
10.如权利要求1所述的完全抗原、如权利要求8所述的单克隆抗体在制备检测ALU115和ALU247的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种游离核酸alu115和alu247完全抗原，其特征在于：所述完全抗原为alu半抗原与蛋白质载体偶联后形成，所述alu半抗原分别为含有氨基标记的alu115核酸片段和alu247核酸片段。
2.根据权利要求1所述的游离核酸alu115和alu247完全抗原，其特征在于：所述蛋白质载体为牛血清白蛋白bsa。
3.如权利要求1或2所述的游离核酸alu115和alu247完全抗原的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，pcr反应体系为：12.5μlsybr greenⅰbufferamix；taq酶0.5μl；alu115和aul247上下游引物各0.8μl；基因组dna样本2μl；加入无菌水到25μl。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述sybr greenⅰbuffer amix的组成包括：20mm tris-so4、100mm kcl、0.3mm甜菜碱、20％甘油、0.2mm dntp、sybr greenⅰ和0.5mm mgcl...
【专利技术属性】
技术研发人员：张陆明，胡伯里，顾建梅，
申请(专利权)人：江苏普若维生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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