【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固定化酶法制备l-2-氨基丁酸的，尤其涉及一种用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，以及该共固定化酶的制备及利用该共固定化三酶体系催化反应制备l-2-氨基丁酸的方法。
技术介绍
1、l-2-氨基丁酸是一种能抑制人体神经信息传递并促进脑细胞代谢的非天然手性氨基酸，也是重要的化工原料和医药中间体，广泛应用于医药、农药及食品领域，其中在医药领域，广泛用于多种手性药物的合成，例如l-2-氨基丁酸是合成新型抗癫痫药左乙拉西坦的主要生产原料，也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐的关键手性前体。
2、目前制备l-2-氨基丁酸主要有化学法与生物法。传统的化学制备法主要采用酮丁酸还原法、脱硫反应法、卤代氨解法、化学拆分法等，化学法的缺点是易形成消旋体，不利于手性化合物的合成，且反应条件严苛、环境污染严重，不符合工业发展趋势。生物制备法多采用的是生物酶法，以氨基酰化酶、氨基酸氧化酶、腈水合酶、转氨酶、脱氢酶等生物酶作为催化剂，反应条件温和、立体选择性高，而且绿色环保，具备化学合成法无可比拟的优势，但用作催化剂的游离酶存在催化剂成本高、难以回收再利用，酶活力稳定性差、易失活，与产物混在一起增加分离纯化负担等缺点。例如目前转化率较高的一种生物酶法制备l-2-氨基丁酸是同时采用苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶三种游离酶，这三种游离酶共同使用较难回收再利用，且辅酶再生效率低，产物纯化复杂。为解决游离酶的缺陷，人们通常采用固定化酶的方式，但多种游离酶的相互影响给共固定化体系带来技术难度，故现有技术尚未出现对苏氨酸脱氨酶、亮
技术实现思路
1、为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种共固定化三酶体系，用于催化生产l-2-氨基丁酸。本专利技术的共固定化三酶体系成功将l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶这三种酶共同固定在同一载体即多孔型二氧化硅纳米花上，以实现对l-2-氨基丁酸的高效催化合成、产物有效分离、辅酶循环再生和酶的重复利用。
2、本专利技术的用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，由l-苏氨酸脱氨酶(ltd)、l-亮氨酸脱氢酶(ldh)和甲酸脱氢酶(fdh)共同固定在多孔型载体二氧化硅纳米花上得到，制备共固定化三酶体系所用l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.1～2):1:(1～10)。
3、利用特定多孔型载体二氧化硅纳米花，实现对ltd、ldh和fdh这三种酶的共同固定，有效提高了ltd对2-酮丁酸的底物耐受性、三种酶稳定性及重复使用性。使用该共固定化三酶体系催化生产l-2-氨基丁酸，不仅反应产率高，而且产物便于分离，能够简化合成与后续分离纯化步骤，有效降低生产成本。
4、作为对上述技术方案的限定，l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶依照下述任一种方式固定在载体二氧化硅纳米花上：
5、(1)、按先后顺序依次将l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶固定在载体二氧化硅纳米花上，记为ltd+ldh+fdh；
6、(2)、按先后顺序依次将l-亮氨酸脱氢酶、l-苏氨酸脱氨酶和甲酸脱氢酶固定在载体二氧化硅纳米花上，记为ldh+ltd+fdh；
7、(3)、将l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶同时固定在载体二氧化硅纳米花上，记为(ltd+ldh+fdh)；
8、(4)、在载体二氧化硅纳米花上先固定l-苏氨酸脱氨酶，再同时固定l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，记为ltd+(ldh+fdh)；
9、(5)、在载体二氧化硅纳米花上先固定l-亮氨酸脱氢酶，再同时固定l-苏氨酸脱氨酶和甲酸脱氢酶，记为ldh+(ltd+fdh)。
10、作为对上述技术方案的限定，制备共固定化三酶体系所用l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.5～1):1:(1～10)。
11、作为对上述技术方案的限定，载体二氧化硅纳米花是以十六烷基三甲基溴化铵为模板，硅酸四乙酯为硅源，正丁醇和环己烷为有机相，水为溶剂，尿素为表面活性剂，在60～80℃下搅拌反应后烘干、煅烧制得。
12、作为对上述技术方案的限定，l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶与载体混合后，在25～35℃、ph 7.0～9.0的条件下充分震荡进行固定化。
13、进一步完善共固定化酶的条件，为酶创造适宜的催化环境，从而优化固定化酶性能，使其具备催化率高、稳定性高、容易回收与重复使用等优势。
14、同时，本专利技术还提供了如上所述共固定化三酶体系的制备方法，包括以下操作步骤：将经过戊二醛活化后的多孔型载体二氧化硅纳米花，与pbs缓冲溶液以及l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶三种酶混合，得到的混悬液在25～35℃、ph 7.0～9.0的条件下充分震荡进行固定化，得到共固定化酶体系。
15、作为对上述技术方案的限定，固定化过程载体与总酶量的质量比为1:0.6～1.2。
16、共固定化三酶体系的制备简单便捷，条件温和，利于该共固定化酶在l-2-氨基丁酸的生产应用。
17、另外，本专利技术还提供了一种l-2-氨基丁酸的制备方法，是将上述共固定化三酶体系用作由l-苏氨酸制备l-2-氨基丁酸的合成反应催化剂。
18、作为对上述技术方案的限定，合成反应条件为将100～500mm l-苏氨酸、0.4～2m甲酸钠、质量浓度0.25～2.5％的nadh、ph 7.0～9.0的缓冲溶液以及适量的共固定化酶，在25～35℃震荡反应12～20h。
19、使用本专利技术的共固定化酶催化合成l-2-氨基丁酸，产率达到92％以上，并能实现反应后产物的有效分离、酶的回收再利用以及辅酶循环再生，可有效简化合成步骤与后续分离纯化步骤，降低生产成本。
20、综上所述，本专利技术成功将l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共固定于多孔型载体二氧化硅纳米上，形成的共固定化三酶体系提高了l-亮氨酸脱氢酶对2-酮丁酸的底物耐受性、三种天然酶的稳定性与贮藏性以及重复使用性。利用本专利技术的共固定化三酶体系催化合成l-2-氨基丁酸，可以实现酶的回收再利用与辅酶循环再生，简化合成步骤与后续分离纯化步骤，优化工艺过程，降低生产成本。
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1.一种用于制备L-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：该共固定化三酶体系由L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共同固定在多孔型载体二氧化硅纳米花上得到，制备共固定化三酶体系所用L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.1～2):1:(1～10)。
2.根据权利要求1所述用于制备L-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于，L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶依照下述任一种方式固定在载体二氧化硅纳米花上：
3.根据权利要求1所述用于制备L-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：制备共固定化三酶体系所用L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.5～1):1:(1～10)。
4.根据权利要求1所述用于制备L-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：载体二氧化硅纳米花是以十六烷基三甲基溴化铵为模板，硅酸四乙酯为硅源，正丁醇和环己烷为有机相，水为溶剂，尿素为表面活性剂，在60～80℃下搅拌反应后烘干、煅烧制得。
5.根据权利要求1所述用于制备L-2-氨基丁酸的共
6.如权利要求1～5中任一项所述共固定化三酶体系的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
7.根据权利要求6所述共固定化三酶体系的制备方法，其特征在于：固定化过程载体与总酶量的质量比为1:0.6～1.2。
8.一种L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：将权利要求1～5中任一项所述共固定化三酶体系用作由L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸的合成反应催化剂。
9.根据权利要求7所述L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：合成反应条件为将100～500mM L-苏氨酸、0.4～2M甲酸钠、质量浓度0.25～2.5％的NADH、pH 7.0～9.0的缓冲溶液以及共固定化酶，在25～35℃震荡反应12～20h。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：该共固定化三酶体系由l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共同固定在多孔型载体二氧化硅纳米花上得到，制备共固定化三酶体系所用l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.1～2):1:(1～10)。
2.根据权利要求1所述用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于，l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶依照下述任一种方式固定在载体二氧化硅纳米花上：
3.根据权利要求1所述用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：制备共固定化三酶体系所用l-苏氨酸脱氨酶、l-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为(0.5～1):1:(1～10)。
4.根据权利要求1所述用于制备l-2-氨基丁酸的共固定化三酶体系，其特征在于：载体二氧化硅纳米花是以十六烷基三甲基溴化铵为模板，硅酸四乙酯为硅源，正丁醇和环己烷为有机相，水为溶剂，尿素为表面活性剂，在60～80℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜艳军，贾红薇，刘运亭，周丽亚，贺莹，马丽，郑晓冰，刘冠华，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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