【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，本专利技术涉及一种测序方法以及一种试剂盒。
技术介绍
1、测序数据的质量与测序方法和测序文库有关。目前有很多研究致力于测序文库的构建优化及测序方法的优化。
2、对于微量核酸(如低于1ng)文库制备的过程中，核酸质量、制备方法、制备过程中所采用的反应条件包括溶液体系等的不当或异常，如核酸浓度过低、筛选的核酸片段大小不合适、反应体系中的多个组分在特定条件下可能互相作用、互相干扰等，都可能导致制备得质量较低或不合格的文库，以致不能用于测序。
3、而一般地，不同的测序平台都有相适配的文库和测序方法。
4、其中的单分子测序技术、单分子测序平台，一直代表着核酸检测技术的先进方向，早在上世纪八十年代就有人提出了单分子测序。2003年斯坦福大学生物工程系的教授stephen quake博士成功演示了第一个单分子dna测序实验；2008年helicos公司的第一台单分子测序仪(heliscope)上市；2009年korlach与turner在《科学》杂志上发表文献介绍了pacbio单分子测序技术原理，随后，2010年pacbio公司推出了pacbio rs测序系统，并于2011年正式商用。2014年oxfordnanopore公司在agbt(基因组生物学技术进展年会)上展示了其minion测序系统。据报道，上述任一测序平台的single-pass(单程测序)的测序错误率均很高，最高可达30％，而且，错误类型主要是indel(插入缺失)且是随机发生的。一般认为，通过多次读取可降低这种测
5、因而，现有的是适配于边合成边测序的测序平台的文库构建方法和测序方法，均有待改进。
技术实现思路
1、至少为一定程度地解决上述现有技术问题至少之一，本专利技术提供了一种文库制备方法、一种文库制备试剂盒以及一种测序方法。
2、在本专利技术的实施方式中，提供一种制备文库的方法，包括：获取目标核酸分子，该目标核酸分子为双链核酸分子，包括：对源自待测核酸样本的rna进行逆转录，获得逆转录产物，所述逆转录产物包括rna:dna杂合双链，和富集所述逆转录产物中的rna:dna杂合双链，以获得所述目标核酸分子；提供转座复合体，所述转座复合体包含接头和转座酶，所述接头为序列已知的双链核酸分子；使所述目标核酸分子和所述转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，所述转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；提供第一引物，所述第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及使所述转座产物与所述第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得所述文库。
3、上述文库制备方法属于rna文库构建方法，相较于常规rna文库制备，该方法操作简单、利于快速地制得文库，特别适用于低起始量的核酸样本的文库制备；具体地，利用转座复合物对高效富集后的rna:dna杂合双链进行转座处理，通过一个步骤在一个相同的溶液体系就实现了rna:dna杂合双链的片段化、片段化产物的修复以及片段化产物的接头连接，而且，不需纯化或分离地，在上一步反应的溶液体系中加入引物(第一引物)和聚合酶(非热启动dna聚合酶)进行链置换反应以补平转座产物的核酸分子上的缺口，获得两端带有接头的目标核酸分子。利用该方法制备得的文库能够在各种测序平台上进行测序，且利于获得准确的测定结果。
4、根据本专利技术的具体实施方式，该文库构建方法还包括以下附加技术特征中的至少之一。
5、在某些具体实施方式中，待测核酸样本中包含的rna的量或者说进行文库构建的rna的起始量不低于5pg，较佳地不低于于10pg。该实施方式的建库方法能够对该等起始量的核酸实现文库构建，且构建得的文库满足测序的要求。任选地，核酸的起始量不需多于50pg。该实施方式的建库方法对核酸的起始量的要求很低，特别适于核酸难以提取或者珍贵稀有的核酸样本。
6、在某些具体实施方式中，获取目标核酸分子还包括：在进行所述逆转录之前对所述rna进行变性。具体地，在一个示例中，将rna置于65℃中3～10min以实现该变性。如此，能够获得尽量多的处于一级结构的rna，利于更有效进行逆转录。
7、本实施方式对适用的逆转录酶没有限制，该逆转录步骤的目的是为了获得rna:dna杂合体。基于样本中包含不同种类的rna，进行逆转录时可选用不同的引物，如随机引物、特异引物(如oligo dt)等。
8、在某些具体实施方式中，利用混合引物进行逆转录，混合引物包括oligo dt(由t组成的寡核苷酸链)和随机引物。如此，利于该混合引物进行逆转录，能够较均衡地获得各种rna的逆转录产物。
9、具体地，在一个示例中，oligo dt的长度为12～20nt，和/或随机引物的长度为4-8nt。如此，利于有效均衡地实现各种rna的逆转录。可选地，可进一步设置oligo dt和随机引物在逆转录反应体系中的比例为1:2～1:6，如此，能较好地获得各种rna的逆转录产物。
10、在某些具体实施方式中，利用磁珠进行所称的富集。该富集处理一方面为更换反应溶液体系，即通过去除富集后的上清液从而去除逆转录反应溶液体系，另一方面为了使rna:dna杂合体结合到磁珠表面，增加rna:dna杂合体的浓度，以利于更有效地进行后续反应，如对后续转座反应效率的影响。特别地，该富集处理对起始量低的样本的建库(文库构建)是重要的，影响构建得的文库是否能满足测序的要求。
11、磁珠在文库的构建中，使用广泛，但不同磁珠的捕获性能差异较大。其中，引起磁珠性能差异的主要因素如下：(1)磁珠中层基质不同，磁珠的基本性质会有所不同；(2)修饰的官能团不同，磁珠的吸附特性会有所不同，比如羧基修饰基团磁珠，相比羟基基团能够获得更高的产量，非特异性结合更少；(3)不同的颗粒粒径，一般而言，粒径越大磁性越强；(4)官能团修饰工艺不同，会造成官能团密度、臂长不同，所携带的表面电荷、斥力、氢键数量不同，吸附能力会随之改变；(5)磁珠buffer配方不同，效果也会有所不同，如tween-20等润滑剂不同，会影响磁珠的残留；(6)不同反应液的离子强度、ph值等条件会直接影响磁珠功能基团的活性。因此，选择合适的磁珠进行杂交双链的有效富集，利于后续获得准确的检测测定结果。
12、在一些示例中，专利技术人选择和测试一系列市售磁珠发现，利用表面具有羧基修饰基团(羧基或含羧基的基团)的磁珠进行该富集，能够较好地富集目标核酸分子，利于构建高质量文库。特别地，yeasen公司的货号为12601es03磁珠的测试结果较优。
13、利用转座反应对目标核酸分子进行打断(片段化)和接头连接。在某些具体实施方式中，转座复合体为tn5转座复合体，其中包含转座酶为tn5转座酶或其工程酶，包含的接头为一种或者两种序列已知的双链核酸分子，该接头的至少一部分可以与第一引物杂交/互补配对，以进行后续的链置换反应，以及任选的pcr。具体地，在一个示例中，接头具有如seqid 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测序方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前，所述方法包括：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前，所述方法包括：
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，(2)还包括：
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一测序数据和所述第二测序数据均包含多个读段，所述互相校正包括：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述测序误差预测模型是基于所述第一测序数据和所述第二测序数据与参考基因组的比对结果，对朴素贝叶斯模型进行训练获得的；
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述第一预定长度和所述第二预定长度分别独立地不低于20bp，优选不低于25bp；
8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述RNA的起始量为5～50pg；
9.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，利用混合引物进行所述逆转录，所述混合引物包括Oligo dT和随机引物；
10.一种试剂盒
...【技术特征摘要】
1.一种测序方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前，所述方法包括：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前，所述方法包括：
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，(2)还包括：
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一测序数据和所述第二测序数据均包含多个读段，所述互相校正包括：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述测序误差预测模型是基于所述第一测序数据和所述第二测序数据与参考基因组的比对结果，对朴素贝叶斯模型进行训练获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：林群婷，甘广丽，张萌，李改玲，张娟，刘丽春，冯燕，黄梦娴，林玉琪，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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