【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物高通量分子检测方法，特别涉及一种基于openarray芯片的介水原虫和/或蠕虫的高通量分子检测方法，属于环境监测领域。
技术介绍
1、水中对公共健康风险最大的是微生物，水是许多病原体传播的常见媒介。水传播的病原体可以分为三类：细菌、病毒和寄生虫，后者包括原生动物和蠕虫。原生动物是指一种单细胞真核生物，包括孢子虫(细胞内寄生虫)、鞭毛虫(具有尾巴状结构用于运动)、变形虫(使用临时的细胞体突起为假足)和纤毛虫(通过击打多个毛发状结构称为纤毛来运动)。
2、许多介水传播原虫和蠕虫是人畜共患的，即它们可以同时感染人类和动物。它们在环境中的浓度通常比较低，但仍然可能带来相当大的公共卫生风险，引起水中传染性疾病的发生，尤其是老人、儿童和获得性免疫缺陷综合症患者更加容易患病。
3、隐孢子虫是造成发展中国家儿童死亡的很重要的原因之一。蓝氏贾第鞭毛虫(g.lamblia)(也称十二指肠贾第鞭毛虫)污染全球的供水，摄入其囊肿可导致贾第虫病是一种急性自限性胃肠炎。虽然大多数原生动物暴发是由隐孢子虫和贾第虫(“两虫”)引起的，并已经列入《国家生活饮用水卫生标准》，但其他原生动物种类如刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、微孢子虫、棘阿米巴和人芽囊原虫以及一些蠕虫，也与水传播的疫情有关。这些原生动物和蠕虫污染饮用水或休闲水会增加水传播疾病的风险，然而目前鲜有相关信息，和目前的原虫和蠕虫等的高通量检测方法确实存在密切的关系。
4、目前国内外对原虫和蠕虫等病原性寄生虫的检测方法主要有针对单独类型物种的显微镜检
5、显微镜检测的一个主要缺点是无法识别寄生虫的种类，受到光学系统的限制，显微镜检测的分辨率有限，显微镜检测需要训练有素的操作者来正确操作显微镜和识别样本中的微生物，显微镜检测通常需要耗费大量的时间来准备样、观察和识别原虫，对于大规模分析或对于复杂样品时，耗时耗力；
6、实时定量pcr(qpcr)通量较低，每个实验定量一种或者两种目标，样品量和检测目标数较多时需要耗费大量时间，增加了实验的复杂性。
7、流式细胞计数法操作十分复杂，成本很高，流式细胞计数法通常用于检测细胞的数量和大小，对于一些小型的原虫可能需要额外的步骤或技术来增强其检测的灵敏度和准确性，对于未知或不常见的原虫，可能需要定制标记物和染料，进一步增加了实验的复杂性和成本；
8、lamp需要设计多个引物，包括四个特异性引物以及两个环引物，这些引物的设计相对复杂，需要考虑到目标序列的特点，以及引物之间的相互作用，增加了实验的难度，lamp扩增产物通常是混合物，包括不同长度和结构的dna片段，实验结果不易分析。
技术实现思路
1、本专利技术主要针对基于显微镜检测、定量qpcr、巢氏pcr，流式细胞计数法，以及环介质等温扩增等方法检测原虫、蠕虫等病原性寄生虫存在检测结果准确性差，检测灵敏度低；耗时耗力；操作方法复杂，实验难度高、实验结果分析难度大、检测步骤繁琐，检测成本高；检测方法的稳定性差等技术问题，提供一种基于openarray芯片的介水原虫和/或蠕虫的高通量分子检测方法，本专利技术方法基于openarray芯片设计检测目标物种为22种介水原虫、蠕虫的引物探针，进行实时荧光pcr检测，可实现192个样品的22个目标物种的同时检测，极大的缩短了检测时间，显著提供检测效率，减少人工操作、减少人工操作误差，检测速度快，检测结果准确性高，实现了介水传播原虫和蠕虫的高通量分子检测。
2、为实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种介水原虫和/或蠕虫的高通量分子检测方法，包括如下进行的步骤：
3、1)设计引物、探针
4、依据待检测目标物种的特异性基因选择目的基因，通过primer设计引物、探针；
5、2)制备阳性对照质粒
6、首先：以步骤1)中设计引物、探针时所选择的目标物种的目的基因为基础，截取正向引物前面20bp作为阳性质粒制备的目的基因的开始位置；截取反向引物后面20bp作为阳性质粒制备的目的基因的结束位置，获得各目标物种分别对应的阳性质粒制备的目的基因；接着：将各目标物种对应的阳性质粒制备的目的基因、16s rrna基因、18s rrna基因，克隆至大肠杆菌克隆载体上，获得阳性质粒；
7、3)提取采集的环境样本的dna，获得环境待测样本dna，备用；
8、4)制备加样openarray芯片
9、4-1)首先：按照基因表达芯片的版式，在下载的sample tracker软件中的96孔板上加载待检样品的名称及各样品在96孔板上的位置信息；接着：再通过sample tracker软件将96孔板上样品的名称、位置信息分别对应到384孔板(openarray芯片专属384孔板)上；然后：通过sample tracker软件，将各待检样品在96孔板、384孔板中加样排列方式(即样品排版方式)的文件导出，并准确记录；
10、4-2)按照步骤4-1)中导出的加样排列方式(样品排版方式)将待检样品分别加入到96孔板的对应的小孔中；
11、4-3)向openarray芯片专属384孔板中加入real-time pcr master mix(即openarray反应预混液)；接着按照步骤4-1)中导出的加样排列方式将96孔板中的待检样品dna分别加入到384孔板中对应的小孔内；封膜，制得加样384孔板；
12、4-4)将步骤4-3)制备的加样384孔板置于accufill仪器的384模块上，将openarray芯片置于accufill仪器的plate holder上，其中open array芯片的barcode面朝上放在plate holder的左面；开启accufill仪器，将加样384孔板上的待检样品转移至openarray芯片上，制得加样openarray芯片；
13、5)实时荧光pcr检测
14、将步骤4)制备的加样openarray芯片置于applied biosystems quantstudio 12kflex system仪器中，进行实时荧光定量pcr检测，测定样品中含有的各物种的目的基因的ct值，从而获知环境样本中的介水原虫、蠕虫的种类、含量。
15、其中，步骤1)中所述的待检测目标物种为22种介水原虫、蠕虫，具体为：贾第鞭毛虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、微小隐孢子虫、人型隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、溶组织内阿米巴、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属、卡伯特森氏棘阿米巴、卡氏棘阿米巴、多噬棘阿米巴、环孢子虫、刚地弓形虫、人芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫、脑炎微孢子虫属、贝氏等孢子球虫、结肠小袋纤毛虫、血吸虫属、麦地那龙线虫、棘球绦虫。
16、特别是，所述检测22种介水原虫、蠕本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种介水原虫和/或蠕虫的高通量分子检测方法，其特征是，包括如下进行的步骤：
2.如权利要求1所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤1)中所述的待检测目标物种为22种介水原虫、蠕虫，具体为：贾第鞭毛虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、微小隐孢子虫、人型隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、溶组织内阿米巴、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属、卡伯特森氏棘阿米巴、卡氏棘阿米巴、多噬棘阿米巴、环孢子虫、刚地弓形虫、人芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫、脑炎微孢子虫属、贝氏等孢子球虫、结肠小袋纤毛虫、血吸虫属、麦地那龙线虫、棘球绦虫。
3.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，所述检测22种介水原虫、蠕虫的引物、探针分别为：
4.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤3)中所述的采集的环境样本为水样，则先采用碳酸钙絮凝法对环境水样样本进行浓缩、富集处理，获得浓缩样品后再提取水样样本的DNA。
5.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤4-1)中所述的待检样品为环境待测样本、阳性对照质粒、阴性对照去RNA酶水。
7.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤4-4)中所述的OpenArray芯片的每个子阵的小孔内固定待检测目标物种所对应的引物和探针。
8.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，在OpenArray芯片的每个子阵中，每个待检测目标物种的引物、探针至少固定在2个小孔内。
9.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤5)中所述实时荧光定量PCR检测反应条件为：预变性：50℃，2分钟；95℃，10分钟；变性：95℃，15秒；退火和延伸：60℃，60秒；40个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种介水原虫和/或蠕虫的高通量分子检测方法，其特征是，包括如下进行的步骤：
2.如权利要求1所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤1)中所述的待检测目标物种为22种介水原虫、蠕虫，具体为：贾第鞭毛虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、微小隐孢子虫、人型隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、溶组织内阿米巴、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属、卡伯特森氏棘阿米巴、卡氏棘阿米巴、多噬棘阿米巴、环孢子虫、刚地弓形虫、人芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫、脑炎微孢子虫属、贝氏等孢子球虫、结肠小袋纤毛虫、血吸虫属、麦地那龙线虫、棘球绦虫。
3.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，所述检测22种介水原虫、蠕虫的引物、探针分别为：
4.如权利要求1或2所述的高通量分子检测方法，其特征是，步骤3)中所述的采集的环境样本为水样，则先采用碳酸钙絮凝法对环境水样样本进行浓缩、富集处理，获得浓缩样品后再提取水样样本的dna。
5.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：张昱，段福明，韩子铭，杨敏，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：
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